發(fā)布時間：2017-08-08 15:16

  本文關鍵詞：吲哚胺2，3-雙加氧酶2對小鼠黑色素瘤生長的影響及其在腫瘤治療中的應用研究

  更多相關文章： 吲哚胺2 3-雙加氧酶2 NAD+ ROS 細胞凋亡 細胞周期 黑色素瘤 IDO2 sh RNA 穩(wěn)定轉染 引流淋巴結 IDO2 sh RNA 黑色素瘤 靜脈高壓注射法 腫瘤免疫

【摘要】：第一部分:IDO2表達對黑色素瘤細胞B16-BL6生物學行為的影響目的:研究吲哚胺2,3-雙加氧酶2(IDO2)表達對小鼠黑色素瘤細胞生物學行為的影響。方法:采用IDO2-si RNA沉默小鼠黑色素腫瘤細胞株B16-BL6內(nèi)IDO2的表達后,q PCR檢測IDO2 m RNA的表達水平,Western blot法檢測IDO2蛋白的表達水平,MTT法檢測B16-BL6細胞增殖,流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期,Ehrlich’s法檢測細胞內(nèi)犬尿氨酸生成水平,NAD+/NADH試劑盒檢測細胞內(nèi)NAD+水平,H2DCFDA染色檢測細胞內(nèi)活性氧水平。結果:實時熒光定量PCR法及Western-blot法結果顯示,沉默小鼠黑色素瘤細胞系B16-BL6中IDO2基因后,其m RNA以及蛋白的表達水平均顯著下降,沉默效率達80%以上;MTT結果顯示,沉默IDO2基因后的B16-BL6細胞增殖能力受到明顯抑制;流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn),IDO2基因沉默后B16-BL6細胞的G0/G1期細胞比例明顯增加,而S期和G2/M期細胞比例則明顯降低,其凋亡發(fā)生率明顯增加;Ehrlich’s法結果顯示IDO2基因沉默減少了細胞內(nèi)犬尿氨酸生成;IDO2基因沉默后NAD+生成減少,同時細胞內(nèi)活性氧ROS的含量增加;補充外源性NAD+后IDO2基因沉默引起的細胞凋亡減輕。結論:IDO2在B16-BL6細胞內(nèi)具有酶學活性,沉默B16-BL6細胞內(nèi)IDO2基因的表達可改變腫瘤細胞的生物學特性,包括:抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、使細胞周期積聚在G1期。B16-BL6細胞凋亡與IDO2沉默后NAD+的生成減少有關。第二部分:B16-BL6細胞內(nèi)IDO2基因表達對黑色素瘤形成生長的影響目的:體內(nèi)研究B16-BL6細胞內(nèi)IDO2基因表達對小鼠黑色素瘤生長過程的影響。方法:構建IDO2-sh RNA質粒并進行鑒定;通過G418藥物篩選建立穩(wěn)定細胞系B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-,流式細胞術檢測所構建細胞的綠色熒光百分比,實時熒光定量PCR檢測IDO2 m RNA的表達水平;以B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-細胞在小鼠體內(nèi)建立腫瘤模型,游標卡尺測量腫瘤大小,觀察IDO2表達對黑色素瘤形成、生長的影響;流式細胞儀檢測引流淋巴結內(nèi)Treg和CD8+/CD8+T細胞數(shù)量、T淋巴細胞凋亡率,觀察腫瘤組織內(nèi)IDO2表達對引流淋巴結內(nèi)免疫系統(tǒng)的影響。結果:成功構建IDO2-sh RNA質粒;成功建立B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-穩(wěn)定細胞系:兩種穩(wěn)定細胞攜帶綠色熒光百分比達98%以上,B16-BL6/IDO2-細胞持續(xù)穩(wěn)定低表達IDO2,并且經(jīng)典的刺激因子IFN-g不能誘導其表達上調;與B16-BL6/IDO2+細胞相比,接種B16-BL6/IDO2-細胞至小鼠體內(nèi),其腫瘤形成時間延長、生長速度減慢、腫瘤重量減輕;引流淋巴結內(nèi)Treg百分比下降、CD8+T細胞數(shù)量增加、T淋巴細胞的凋亡減少。結論:黑色素瘤細胞內(nèi)IDO2的表達對腫瘤的生長起著促進作用,且能影響其引流淋巴結內(nèi)腫瘤免疫反應。第三部分:以IDO2為治療靶標進行抗腫瘤治療的研究目的:以IDO2作為治療靶標,研究IDO2基因表達在腫瘤治療中的作用及其對免疫應答的影響。方法:1.IDO2-sh RNA及scramble-sh RNA尾靜脈高壓注射法進行抗腫瘤治療,游標卡尺測量腫瘤大小;流式細胞術檢測各組小鼠脾臟及引流淋巴結內(nèi)Treg細胞百分比、T細胞凋亡百分比,以及脾臟內(nèi)樹突狀細胞表面共刺激分子表達情況;LDH法檢測CD8+T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的能力;3H摻入法檢測淋巴細胞抗原回憶反應;ELISA法檢測血清內(nèi)TNF-a、IFN-g表達水平。2.體外沉默樹突狀細胞內(nèi)的IDO2基因后,流式細胞術檢測樹突狀細胞表面共刺激分子表達水平;IDO2基因沉默的樹突狀細胞與T細胞共培養(yǎng),CFSE標記法檢測異基因混合淋巴細胞反應,流式細胞術檢測Treg細胞百分比。結果:1.IDO2-sh RNA治療組腫瘤的形成時間較晚,腫瘤的生長速度緩慢,離體腫瘤重量明顯減輕;IDO2-sh RNA治療組脾臟及引流淋巴結內(nèi)的Treg細胞百分比減少,T細胞凋亡百分比下降,脾臟樹突狀細胞表面共刺激分子CD80、CD86明顯增加;IDO2-sh RNA治療組小鼠體內(nèi)T細胞抗原回憶能力增加,CD8+T細胞殺傷B16-BL6的能力增強,血清內(nèi)TNF-a、IFN-g表達水平升高。2.體外沉默樹突狀細胞內(nèi)IDO2基因后,表面共刺激分子CD80、CD86的表達百分比增加,樹突狀細胞刺激異基因T淋巴細胞增殖的能力增強,誘導Treg細胞的百分比下降。結論:沉默荷瘤小鼠體內(nèi)IDO2可以有效抑制黑色素瘤生長,提高機體的抗腫瘤免疫反應。
【關鍵詞】：吲哚胺2 3-雙加氧酶2 NAD+ ROS 細胞凋亡 細胞周期 黑色素瘤 IDO2 sh RNA 穩(wěn)定轉染 引流淋巴結 IDO2 sh RNA 黑色素瘤 靜脈高壓注射法 腫瘤免疫
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮寫一覽表12-15
• 引言15-20
• 第一部分 IDO2表達對黑色素瘤細胞B16-BL6生物學行為的影響20-53
• 1 實驗材料與方法20-41
• 1.1 實驗材料20-24
• 1.2 實驗方法24-40
• 1.3 統(tǒng)計學分析40-41
• 2 結果41-48
• 2.1 最佳引物序列41
• 2.2 IDO2在各小鼠腫瘤細胞內(nèi)的表達情況41-42
• 2.3 最佳siRNA序列篩選42
• 2.4 IDO2-siRNA沉默B16-BL6細胞內(nèi)IDO2基因42-44
• 2.5 IDO2基因沉默后酶功能檢測44-45
• 2.6 IDO2基因表達對B16-BL6細胞生物學行為的影響45-48
• 2.7 NAD+抗凋亡實驗48
• 3 討論48-53
• 第二部分 IDO2基因表達對黑色素瘤形成生長的影響53-73
• 1 實驗材料與方法53-64
• 1.1 實驗材料53-54
• 1.2 實驗方法54-64
• 1.3 統(tǒng)計學分析64
• 2 結果64-69
• 2.1 重組質粒IDO2-shRNA的鑒定64
• 2.2 B16-BL6/IDO2 +及B16-BL6/IDO2-穩(wěn)定細胞株的建立64-65
• 2.3 穩(wěn)定細胞株內(nèi)IDO2 mRNA的表達65
• 2.4 穩(wěn)定細胞株對IFN-g誘導反應的檢測65-66
• 2.5 B16-BL6細胞內(nèi)IDO2表達對體內(nèi)腫瘤生長的影響66-67
• 2.6 B16-BL6細胞內(nèi)IDO2表達對腫瘤引流淋巴結免疫環(huán)境的影響67-69
• 3 討論69-73
• 第三部分：以IDO2為治療靶標進行抗腫瘤治療的研究73-103
• 1 實驗材料與方法73-86
• 1.1 實驗材料73-74
• 1.2 實驗方法74-86
• 1.3 統(tǒng)計學分析86
• 2 結果86-97
• 2.1 IDO2-shRNA治療黑色素瘤的抑瘤效果86-87
• 2.2 IDO2-shRNA治療對機體腫瘤免疫反應的影響87-93
• 2.3 IDO2表達對小鼠樹突狀細胞生物學特性及功能的影響93-97
• 3 討論97-103
• 結論103-104
• 致謝104-105
• 參考文獻105-114
• 攻讀學位期間的研究成果114-115
• 綜述115-123
• 參考文獻121-123

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣鐵男,司靜懿,趙維敏,李昆,鮑家駒,張衛(wèi),盛齊,韓銳,徐承熊,戰(zhàn)洪生;揚州光卟啉作用于小鼠黑色素瘤細胞療效原理的超微結構研究[J];中國醫(yī)學科學院學報;1984年06期

2 于智勇;沈維干;薛慶於;武輝;;AdH1-siRNA-Survivin抗小鼠黑色素瘤生長和轉移的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2008年18期

3 李恒,劉廣超,石淵淵;小鼠黑色素瘤凝集的分離純化[J];開封醫(yī)專學報;1999年03期

4 段昕;張紅;邱嶸;高清祥;閔鳳玲;郝冀芳;劉兵;周清明;李小達;王燕玲;周光明;;重離子輻射提高腺病毒介導小鼠黑色素瘤細胞轉染率的研究[J];原子核物理評論;2007年01期

5 馬顯光;蔣洪;孫麗麗;鄧渝;劉俊康;熊繼堯;;中藥和激光對小鼠黑色素瘤的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2011年02期

6 李衛(wèi)泊;尹昱;張峻嶺;謝紹建;周保軍;宋偉慶;蔡建輝;;低劑量循環(huán)應用環(huán)磷酰胺聯(lián)合樹突狀細胞疫苗對小鼠黑色素瘤的治療效果[J];中國生物制品學雜志;2012年06期

7 劉廣超;小鼠黑色素瘤凝集素的制備和特性分析[J];河南醫(yī)學研究;1999年04期

8 趙萬洲,劉紅巖,徐少鋒,Frank Entschladen,Bernd Niggemann,KurtS.Zaenker,韓銳;小鼠黑色素瘤某些生物學特性與其侵襲潛能的相關性研究[J];中華腫瘤雜志;2001年04期

9 房東亮;馬躍美;趙秀蘭;孫濤;劉艷榮;王倩;田原;;慢性炎癥對小鼠黑色素瘤血管生成的影響[J];天津醫(yī)藥;2013年03期

10 成秉辰;;千里光總堿對體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤細胞增殖的影響[J];黑龍江醫(yī)學;2009年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙萬洲;劉紅巖;徐少峰;Frank Entschladen;Bernd Niggemann;Kurt S．Zanker;韓銳;;小鼠黑色素瘤生物學特性與其侵襲潛能的相關性研究[A];2000全國腫瘤學術大會論文集[C];2000年

2 黃亞渝;馬加海;董海龍;葉菁;陳廣生;張秀敏;隋延仿;;增強型綠色熒光蛋白與MAGE-n共表達載體的構建及表達[A];中華醫(yī)學會病理學分會2005年學術年會論文匯編[C];2005年

3 杜麗娜;付杰;劉洋樸;鄒云彭;金義光;;姜黃素及其包和物原位凝膠對小鼠黑色素瘤細胞B16的抑制作用[A];第十一屆全國青年藥學工作者最新科研成果交流會論文集[C];2012年

4 方麗娟;錢關祥;;基因修飾小鼠黑色素瘤細胞誘導抗腫瘤免疫效應的研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學學會2006年學術交流會論文集[C];2006年

5 王青青;余海;鞠佃文;潘建平;何龍;夏大靜;張立煌;曹雪濤;;腺病毒介導的Lymphotactin基因療法對單抗導向的超抗原治療小鼠黑色素瘤的增強效應[A];第七屆全國腫瘤生物治療學術會議論文集[C];2001年

6 劉月彩;單保恩;張超;王欣榮;;促紅細胞生成素通過調節(jié)Bcl-2家族蛋白表達影響小鼠黑色素瘤細胞株B16的生長[A];河北省免疫學會第六次免疫學大會資料匯編[C];2010年

7 胡巍;張超;方蕓;;霧化吸入羥基喜樹堿對小鼠黑色素瘤肺轉移的藥效學及體外作用機制研究[A];2010施慧達杯第十屆全國青年藥學工作者最新科研成果交流會論文集[C];2010年

8 黃丹;丁巖;陳曉光;;3—7—1的抗腫瘤作用及其作用機制研究[A];中國藥理學會第八次全國代表大會暨全國藥理學術會議論文摘要匯編[C];2002年

9 孫寶勝;劉士新;趙玲;;Taurolidine聯(lián)合X射線通過誘導小鼠黑色素瘤細胞G2/M期阻滯去除提高輻射敏感性[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術年會論文集[C];2007年

10 紀超;康健;陳文琦;楊波;萬寅生;畢志剛;;核黃素削弱EGF誘導的小鼠黑色素瘤B16細胞株AQP3上調以及細胞遷移增加[A];中華醫(yī)學會第14次全國皮膚性病學術年會論文匯編[C];2008年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 劉燕玲;吲哚胺2，，3-雙加氧酶2對小鼠黑色素瘤生長的影響及其在腫瘤治療中的應用研究[D];南昌大學;2016年

2 楊明;CpG ODN-MF59輔佐腫瘤抗原誘導抗小鼠黑色素瘤及肺癌的實驗研究[D];吉林大學;2012年

3 鄧燕杰;人RI基因在臍血干細胞中的轉染表達及對小鼠黑色素瘤基因治療的研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

4 盛敏佳;PDPN與CLEC-2促進血小板介導的小鼠黑色素瘤肺轉移的實驗研究[D];吉林大學;2015年

5 傅攀峰;逆轉錄病毒介導的人核糖核酸酶抑制因子對小鼠黑色素瘤基因治療的研究[D];大連醫(yī)科大學;2003年

6 陳海輝;中頻交變電場對小鼠黑色素瘤離體細胞和皮下移植瘤的作用研究[D];中南大學;2012年

7 Samuel Essien-Baidoo;[D];江蘇大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 翟國勤;仙臺病毒囊膜抗小鼠黑色素瘤的研究[D];揚州大學;2011年

2 李歡;高強度聚焦超聲輻照抑制小鼠黑色素瘤轉移的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

3 許靈會;多基因聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤的實驗研究[D];延邊大學;2014年

4 彭細毛;口服重組沙門菌SL7207/mtHSP70/HSV-TK靶向抗小鼠黑色素瘤實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

5 楊善花;IL-24基因治療小鼠黑色素瘤的實驗研究[D];延邊大學;2012年

6 孫淑娟;大鼠間充質干細胞對小鼠黑色素瘤影響的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2013年

7 曹卉;小鼠黑色素瘤B16移植瘤模型的建立[D];延邊大學;2008年

8 康斯斯;白藜蘆醇對小鼠黑色素瘤RUNX3基因的作用及機制[D];華中科技大學;2012年

9 劉艷榮;局部微環(huán)境在小鼠黑色素瘤線形程序性壞死形成中的作用及分子機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2010年

10 蒙東才;BCT的抗腫瘤作用及其機制研究[D];蘇州大學;2009年

本文編號：640638