本文關(guān)鍵詞：吲哚胺2，3-雙加氧酶2對(duì)小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)的影響及其在腫瘤治療中的應(yīng)用研究

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【摘要】：第一部分:IDO2表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6生物學(xué)行為的影響目的:研究吲哚胺2,3-雙加氧酶2(IDO2)表達(dá)對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法:采用IDO2-si RNA沉默小鼠黑色素腫瘤細(xì)胞株B16-BL6內(nèi)IDO2的表達(dá)后,q PCR檢測(cè)IDO2 m RNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測(cè)IDO2蛋白的表達(dá)水平,MTT法檢測(cè)B16-BL6細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,Ehrlich’s法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)犬尿氨酸生成水平,NAD+/NADH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NAD+水平,H2DCFDA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western-blot法結(jié)果顯示,沉默小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-BL6中IDO2基因后,其m RNA以及蛋白的表達(dá)水平均顯著下降,沉默效率達(dá)80%以上;MTT結(jié)果顯示,沉默IDO2基因后的B16-BL6細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),IDO2基因沉默后B16-BL6細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期和G2/M期細(xì)胞比例則明顯降低,其凋亡發(fā)生率明顯增加;Ehrlich’s法結(jié)果顯示IDO2基因沉默減少了細(xì)胞內(nèi)犬尿氨酸生成;IDO2基因沉默后NAD+生成減少,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的含量增加;補(bǔ)充外源性NAD+后IDO2基因沉默引起的細(xì)胞凋亡減輕。結(jié)論:IDO2在B16-BL6細(xì)胞內(nèi)具有酶學(xué)活性,沉默B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2基因的表達(dá)可改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性,包括:抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、使細(xì)胞周期積聚在G1期。B16-BL6細(xì)胞凋亡與IDO2沉默后NAD+的生成減少有關(guān)。第二部分:B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2基因表達(dá)對(duì)黑色素瘤形成生長(zhǎng)的影響目的:體內(nèi)研究B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2基因表達(dá)對(duì)小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)過程的影響。方法:構(gòu)建IDO2-sh RNA質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定;通過G418藥物篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞系B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所構(gòu)建細(xì)胞的綠色熒光百分比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IDO2 m RNA的表達(dá)水平;以B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-細(xì)胞在小鼠體內(nèi)建立腫瘤模型,游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小,觀察IDO2表達(dá)對(duì)黑色素瘤形成、生長(zhǎng)的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg和CD8+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)胞凋亡率,觀察腫瘤組織內(nèi)IDO2表達(dá)對(duì)引流淋巴結(jié)內(nèi)免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建IDO2-sh RNA質(zhì)粒;成功建立B16-BL6/IDO2+及B16-BL6/IDO2-穩(wěn)定細(xì)胞系:兩種穩(wěn)定細(xì)胞攜帶綠色熒光百分比達(dá)98%以上,B16-BL6/IDO2-細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定低表達(dá)IDO2,并且經(jīng)典的刺激因子IFN-g不能誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào);與B16-BL6/IDO2+細(xì)胞相比,接種B16-BL6/IDO2-細(xì)胞至小鼠體內(nèi),其腫瘤形成時(shí)間延長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度減慢、腫瘤重量減輕;引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg百分比下降、CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加、T淋巴細(xì)胞的凋亡減少。結(jié)論:黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)IDO2的表達(dá)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起著促進(jìn)作用,且能影響其引流淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤免疫反應(yīng)。第三部分:以IDO2為治療靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤治療的研究目的:以IDO2作為治療靶標(biāo),研究IDO2基因表達(dá)在腫瘤治療中的作用及其對(duì)免疫應(yīng)答的影響。方法:1.IDO2-sh RNA及scramble-sh RNA尾靜脈高壓注射法進(jìn)行抗腫瘤治療,游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)內(nèi)Treg細(xì)胞百分比、T細(xì)胞凋亡百分比,以及脾臟內(nèi)樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)情況;LDH法檢測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力;3H摻入法檢測(cè)淋巴細(xì)胞抗原回憶反應(yīng);ELISA法檢測(cè)血清內(nèi)TNF-a、IFN-g表達(dá)水平。2.體外沉默樹突狀細(xì)胞內(nèi)的IDO2基因后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)水平;IDO2基因沉默的樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng),CFSE標(biāo)記法檢測(cè)異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞百分比。結(jié)果:1.IDO2-sh RNA治療組腫瘤的形成時(shí)間較晚,腫瘤的生長(zhǎng)速度緩慢,離體腫瘤重量明顯減輕;IDO2-sh RNA治療組脾臟及引流淋巴結(jié)內(nèi)的Treg細(xì)胞百分比減少,T細(xì)胞凋亡百分比下降,脾臟樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86明顯增加;IDO2-sh RNA治療組小鼠體內(nèi)T細(xì)胞抗原回憶能力增加,CD8+T細(xì)胞殺傷B16-BL6的能力增強(qiáng),血清內(nèi)TNF-a、IFN-g表達(dá)水平升高。2.體外沉默樹突狀細(xì)胞內(nèi)IDO2基因后,表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)百分比增加,樹突狀細(xì)胞刺激異基因T淋巴細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng),誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的百分比下降。結(jié)論:沉默荷瘤小鼠體內(nèi)IDO2可以有效抑制黑色素瘤生長(zhǎng),提高機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：吲哚胺2 3-雙加氧酶2 NAD+ ROS 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期 黑色素瘤 IDO2 sh RNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 引流淋巴結(jié) IDO2 sh RNA 黑色素瘤 靜脈高壓注射法 腫瘤免疫
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮寫一覽表12-15
• 引言15-20
• 第一部分 IDO2表達(dá)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16-BL6生物學(xué)行為的影響20-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法20-41
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-40
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析40-41
• 2 結(jié)果41-48
• 2.1 最佳引物序列41
• 2.2 IDO2在各小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況41-42
• 2.3 最佳siRNA序列篩選42
• 2.4 IDO2-siRNA沉默B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2基因42-44
• 2.5 IDO2基因沉默后酶功能檢測(cè)44-45
• 2.6 IDO2基因表達(dá)對(duì)B16-BL6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響45-48
• 2.7 NAD+抗凋亡實(shí)驗(yàn)48
• 3 討論48-53
• 第二部分 IDO2基因表達(dá)對(duì)黑色素瘤形成生長(zhǎng)的影響53-73
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法53-64
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料53-54
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法54-64
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析64
• 2 結(jié)果64-69
• 2.1 重組質(zhì)粒IDO2-shRNA的鑒定64
• 2.2 B16-BL6/IDO2 +及B16-BL6/IDO2-穩(wěn)定細(xì)胞株的建立64-65
• 2.3 穩(wěn)定細(xì)胞株內(nèi)IDO2 mRNA的表達(dá)65
• 2.4 穩(wěn)定細(xì)胞株對(duì)IFN-g誘導(dǎo)反應(yīng)的檢測(cè)65-66
• 2.5 B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2表達(dá)對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響66-67
• 2.6 B16-BL6細(xì)胞內(nèi)IDO2表達(dá)對(duì)腫瘤引流淋巴結(jié)免疫環(huán)境的影響67-69
• 3 討論69-73
• 第三部分：以IDO2為治療靶標(biāo)進(jìn)行抗腫瘤治療的研究73-103
• 1 實(shí)驗(yàn)材料與方法73-86
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料73-74
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法74-86
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析86
• 2 結(jié)果86-97
• 2.1 IDO2-shRNA治療黑色素瘤的抑瘤效果86-87
• 2.2 IDO2-shRNA治療對(duì)機(jī)體腫瘤免疫反應(yīng)的影響87-93
• 2.3 IDO2表達(dá)對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的影響93-97
• 3 討論97-103
• 結(jié)論103-104
• 致謝104-105
• 參考文獻(xiàn)105-114
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果114-115
• 綜述115-123
• 參考文獻(xiàn)121-123

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本文編號(hào)：640638