本文關鍵詞：表皮特異性Cdc42基因敲除對小鼠皮膚發(fā)育的影響及其作用機制

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【摘要】：皮膚是人體最大器官,其正常胚胎發(fā)育以及成體自我更新對于形成人體與外界環(huán)境之間的屏障非常重要。皮膚發(fā)育和自我更新是一個復雜的生物學過程,經(jīng)歷了角質形成細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學事件,彼此處于動態(tài)平衡,受到多信號轉導途徑精細而復雜的調節(jié),但迄今關于皮膚發(fā)育的分子信號機制遠未闡明。Cdc42是小G蛋白Rho家族蛋白中的重要成員,體內的Cdc42有兩種形式,即GDP結合的無活性狀態(tài)與GTP結合的活性狀態(tài)。Cdc42在細胞信號轉導通路中具有分子開關作用�；罨腃dc42通過作用于細胞內一系列下游效應底物來影響細胞的生長、分化、凋亡和細胞周期等一系列重要生命現(xiàn)象,其最重要的功能是調節(jié)肌動蛋白細胞骨架重組。近期研究發(fā)現(xiàn),小G蛋白Rho家族對角質形成細胞的增殖、分化和凋亡具有重要調控作用。本課題組前期研究揭示RhoA可以通過MEKK1/JNK信號通路調控角質形成細胞的增殖與分化,促進皮膚創(chuàng)傷愈合。但是,關于Cdc42在皮膚發(fā)育與自我更新中的作用鮮有報道。近期課題組成功建立表皮特異性Cdc42基因敲除小鼠,結果出人意料的是小鼠于出生后24h內發(fā)生死亡。提示Cdc42在皮膚發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。本課題擬運用轉基因小鼠模型,探討Cdc42在皮膚發(fā)育的作用及其可能作用機制,進而探索皮膚發(fā)育的復雜信號機制,從而為研究和治療各種皮膚病奠定堅實的理論基礎。一、表皮特異性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立(一)目的 為載體水平研究Cdc42基因在皮膚發(fā)育中的作用提供有效研究工具。(二)方法利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng),將Cdc42loxp/loxp小鼠和K14-Cre轉基因小鼠進行雜交,培育出Cdc42基因半敲除小鼠,基因型為Cdc42loxp/+/K 14-Cre(+)。而后利用Cdc42loxp/+/K 14-Cre(+)小鼠與Cdc42loxp/loxp小鼠雜交,其后代獲取1/4比例Cdc42基因全敲除小鼠,簡稱KO小鼠,基因型為Cdc42loxp/loxp/K14-Cre(+);獲取1/2比例Cdc42基因未敲除小鼠,簡稱WT小鼠,基因型為Cdc42loxp/+/K14-Cre(-)或Cdc42loxp/loxp/K14-Cre(-).通過PCR方法和Cdc42免疫組織化學方法進行基因鑒定。按照準確的日齡取E14.5-E18.5天的鼠胚和出生乳鼠P1。將鼠胚或乳鼠放入4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片和染色。(三)結果1.經(jīng)PCR基因鑒定,K14-Cre(+)可見496bp和200bp兩條特異條帶,Cdc42loxP/loxP可見465bp一條特異性條帶。K14-Cre(+)且Cdc42loxP/loxP的小鼠為KO小鼠。2.通過免疫組織化學方法進行基因鑒定,KO小鼠于E15.5僅在表皮基底細胞尚有Cdc42表達,隨著胚胎的發(fā)育,基底細胞Cdc42表達逐漸減弱,出生后基底細胞Cdc42表達幾乎完全消失。結果證明,隨著胚胎的發(fā)育,KO小鼠表皮Cdc42基因被有效敲除。3.KO小鼠于出生后24h內發(fā)生死亡。與WT小鼠比較,E17.5-P1的KO小鼠體型矮小,且體重差異具有統(tǒng)計學意義。KO乳鼠皮膚表型異常,皮膚潮紅光亮,似綢緞。(四)結論成功建立表皮特異性Cdc42基因敲除小鼠。二、轉基因小鼠重要內臟器官的組織形態(tài)學觀察(一)目的判斷Cdc42基因敲除是否影響了重要內臟器官的發(fā)育而導致KO小鼠的死亡。(二)方法通過HE染色觀察KO小鼠肝臟、腎臟、肺和心臟在發(fā)育過程中的組織形態(tài)學變化；應用PAS染色觀察KO小鼠在肝臟發(fā)育過程中肝細胞糖原的合成情況。(三)結果除了出生后肝臟、腎臟、肺和心臟出現(xiàn)淤血現(xiàn)象,實質細胞發(fā)生水腫變性外,KO小鼠的肝臟、腎臟和肺在發(fā)育過程中未見明顯組織結構異常。KO小鼠在肝臟發(fā)育過程中未見肝細胞糖原合成異常。(四)結論Cdc42基因敲除沒有干預小鼠重要內臟器官的發(fā)育。三、Cdc42基因敲除對小鼠皮膚發(fā)育的影響及其作用機制(一)目的探討Cdc42基因敲除對小鼠皮膚發(fā)育的影響及其可能作用機制。(二)方法利用皮膚通透性分析和脫水測試分析,檢測KO乳鼠皮膚屏障功能。通過HE染色和PAS染色,對KO小鼠腹部皮膚的組織形態(tài)學結構進行動態(tài)觀察；通過掃描電鏡和透射電鏡觀察KO乳鼠皮膚超微結構變化。通過免疫組織化學法檢測K19、K15、K14、K1、K6、Loricrin 和 Involucrin的表達,研究Cdc42基因敲除對表皮干細胞的影響及其對角質形成細胞分化的影響。通過BrdU染色和TUNEL法檢測Cdc42基因敲除對皮膚發(fā)育過程中表皮角質形成細胞增殖和凋亡的影響。通過免疫組織化學熒光法檢鋇β-catenin、E-Cadherin、 Desmoplakin、ZO-1和a6-intergrin的表達,觀察KO小鼠皮膚發(fā)育過程中角質形成細胞連接的變化。通過免疫組織化學法檢測p-ERK、p-JNK、p-p38和p-c-Jun的表達,研究Cdc42在小鼠皮膚發(fā)育中的作用機制。(三)結果1.KO小鼠表皮屏障功能破壞：經(jīng)皮膚通透性分析,KO小鼠與WT小鼠相似,生物素染料未滲入表皮角質層下方,但KO小鼠角質層染色明顯加深；經(jīng)脫水檢測分析,WT小鼠在KO小鼠生存時間內體重僅下降約1.5%,而KO小鼠體重下降約5%,證實KO小鼠存在嚴重脫水現(xiàn)象。2.KO小鼠表皮組織結構異常：HE染色結果顯示,Cdc42基因敲除造成表皮組織結構異常。E15.5,KO小鼠表皮開始出現(xiàn)異常,沒有明顯表皮嵴狀突起形成,皮膚表面平坦。P1,KO小鼠表皮輕度增厚；局部基底細胞與棘細胞之間以及相鄰棘細胞之間的間隙增寬,棘細胞皺縮,細胞間橋拉長,清晰可見；局部表皮基底細胞排列不整齊,細胞形態(tài)不規(guī)則；WT小鼠角質層較疏松,呈剝脫狀,而KO小鼠表皮角質層較致密。PAS染色結果顯示,KO小鼠皮膚發(fā)育過程中,表皮細胞糖原分布和含量未見明顯異常。掃描電鏡結果顯示,E17.5,WT小鼠皮膚表面有明顯的隆起和深溝,隆起飽滿,表面均勻分布著小顆粒狀凸起,有少量裂隙；而KO小鼠皮膚表面隆起不飽滿,明顯塌陷,皮膚表面有大量裂隙,小顆粒狀突起數(shù)量少且不明顯。P1:WT小鼠皮膚表面表面凹凸不平,呈明顯的波浪狀；表面有許多規(guī)則的小的圓丘狀隆起；而KO小鼠皮膚表面較為平坦；表面的圓丘狀隆起較大且數(shù)量少,部分泡狀隆起有剝脫現(xiàn)象。透射電鏡結果顯示,KO乳鼠表皮基底細胞與棘細胞之間以及棘細胞之間的細胞間隙增寬,細胞間橋拉長,但數(shù)量未見明顯減少；部分基底細胞和棘細胞胞體皺縮,棘細胞較扁平。3.KO小鼠囊間表皮角質形成細胞增殖增加、凋亡減少：BrdU檢測結果顯示,E15.5～E18.5,WT小鼠和KO小鼠BrdU陽性細胞都主要分布在囊間表皮基底層。隨著胚胎的發(fā)育,兩者BrdU陽性細胞數(shù)量均呈下降趨勢。不同點是KO小鼠BrdU陽性細胞數(shù)量均比同齡WT小鼠顯著增多(P0.05)。TUNEL法檢測結果顯示,WT小鼠和KO小鼠囊間表皮角質形成細胞均于E17.5開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,且隨著發(fā)育,二者囊間表皮凋亡細胞數(shù)量均呈增加趨勢,但與WT小鼠比較,KO小鼠囊間表皮凋亡細胞的數(shù)量以及分布部位均發(fā)生改變。KO小鼠囊間表皮陽性細胞數(shù)量明顯少于WT小鼠。WT小鼠陽性細胞分布于顆粒層和整個棘層,甚至基底層,而KO小鼠僅分布在顆粒層和棘層淺部。4.KO小鼠囊間表皮基底細胞可以終末分化,但其分化形式發(fā)生改變：本實驗對E15.5、E17.5和P1三天鼠齡小鼠表皮細胞進行分化指標K14、K6、K1、Loricrin和Incolucrin的檢測。K14主要表達于基底層細胞,是基底細胞有絲分裂活躍的標志蛋白。K1主要表達于基底層上方的表皮細胞,是表皮角質形成細胞終末分化的標記。Loricrin和Incolucrin表達于顆粒層,是表皮角質形成細胞已完成終末分化并正在進行角化過程中的標志性蛋白。K6是一種過渡增殖相關角蛋白,是由處于快速增殖狀態(tài)的角質形成細胞表達,正常情況下囊間表皮細胞不表達K6。K14表達結果顯示W(wǎng)T小鼠K14都表達于囊間表皮基底層細胞和表皮嵴深部的棘細胞,而KO小鼠K14表達范圍明顯增大,囊間表皮基底層細胞和棘層細胞均有表達。K6表達結果顯示W(wǎng)T小鼠囊間表皮細胞不表達K6,而KO小鼠囊間表皮細胞于E17.5在近基底層的棘細胞可見散在細胞表達K6,于P1天所有棘細胞均顯著表達K6。K14表達范圍擴大和K6異位表達說明Cdc42基因敲除改變了角質形成細胞的正常分化形式。K14和K6二者均是與細胞有絲分裂活躍有關的角蛋白。KO小鼠表皮角質形成細胞K6和K14的異常過渡表達也說明Cdc42基因敲除可以引起角質形成細胞增殖能力增強。該實驗結果與BrdU檢測結果一致。K1、Loricrin和Involucrin免疫組化檢測結果顯示KO小鼠表皮細胞在蛋白表達部位和表達量方面未見明顯異常,說明Cdc42基因敲除雖然影響了角質形成細胞的分化形式,但對角質形成細胞的終末分化卻沒有明顯影響。5.KO小鼠囊間表皮干細胞數(shù)量減少：K19和K15是表皮干細胞的標志。K19和K15表達結果顯示KO小鼠與WT小鼠囊間表皮K19和K15表達部位相同,均表達于基底層,但KO小鼠K19和K15陽性表達細胞數(shù)量和表達強度均較同齡WT小鼠明顯下降。說明Cdc42基因敲除導致囊間表皮干細胞數(shù)量減少。6.KO小鼠表皮角質形成細胞間緊密連接和中間連接發(fā)生破壞：本實驗對E15.5、E17.5和P1三天鼠齡小鼠表皮細胞進行不同細胞連接相關結構蛋白進行檢測。ZO-1是緊密連接結構蛋白,檢測結果顯示W(wǎng)T小鼠和KO小鼠表皮細胞ZO-1均表達于基底層細胞和基底層上各層細胞的胞膜部位。WT小鼠E15.5和E17.5天比P1天的ZO-1表達強,以E17.5 ZO-1表達最強。KO小鼠ZO-1表達均比同齡WT小鼠明顯減弱。結果說明Cdc42基因敲除引起了角質形成細胞間緊密連接的破壞。E-Cadherin和β-catenin是中間連接結構蛋白。E-Cadherin表達結果顯示W(wǎng)T小鼠和KO小鼠表皮E-Cadherin均表達于囊間表皮基底細胞的側面和頂面以及基底層上各層細胞的胞膜部位。與WT小鼠比較,KO小鼠表皮E-Cadherin表達出現(xiàn)異常。E17.5,KO小鼠表皮細胞E-Cadherin表達明顯增強,表皮基底層細胞和基底層上細胞均強表達E-Cadherin;P1,KO小鼠表皮細胞E-Cadherin表達卻發(fā)生減弱。WT小鼠和KO小鼠表皮角質形成細胞β-catenin表達與E-Cadherin表達一致。結果說明Cdc42基因敲除引起了角質形成細胞間中間連接的破壞。Desmoplakin是橋粒結構蛋白,a6-intergrin是半橋粒結構蛋白。免疫組化結果顯示W(wǎng)T小鼠和KO小鼠表皮Desmoplakin和a6-intergrin表達未見明顯異常。結果說Cdc42基因敲除對橋粒和半橋粒沒有明顯影響。7. p-JNK、p-p38、p-ERK和p-c-Jun的表達結果：KO小鼠和WT小鼠表皮細胞p-p38和p-JNK表達結果一致。結果顯示E15.5、E17.5和P1三天鼠齡的KO小鼠和WT小鼠表皮各層角質形成細胞均表達p-p38和p-JNK,未見顯著差異。p-ERK表達結果顯示皮膚發(fā)育過程中,WT小鼠角質形成細胞p-ERK的表達呈動態(tài)變化：E15.5和E16.5, p-ERK強表達在基底層上細胞；E17.5,p-ERK表達明顯減弱；P1,p-ERK未見陽性表達。與WT小鼠比較,KO小鼠僅在E16.5有少量散在的基底層上細胞表達p-ERK,其余時間均未見陽性表達。p-c-Jun表達結果顯示皮膚發(fā)育過程中,WT小鼠角質形成細胞p-c-Jun表達呈動態(tài)變化：E15.5,表皮各層可見散在陽性細胞分布；E17.5,表皮陽性細胞數(shù)量明顯增多,其中顆粒層陽性表達強；P1,表皮陽性細胞數(shù)量顯著減少,僅在顆粒層有極少量分布。與WT小鼠比較,E15.5,KO小鼠表皮p-c-Jun表達未見明顯差異；E17.5,KO小鼠表皮陽性細胞主要分布在棘層淺層和顆粒層,其陽性細胞數(shù)比WT小鼠明顯減少；P1,KO小鼠表皮陽性細胞也分布在顆粒層,但其陽性細胞數(shù)比WT小鼠增多。(四)結論1.Cdc42對維持表皮角質形成細胞間緊密連接和中間連接具有重要作用。2.Cdc42基因敲除引起囊間表皮干細胞數(shù)量減少,破壞表皮自我更新。3.Cdc42基因敲除對表皮角質形成細胞凋亡具有抑制作用。4.Cdc42可能通過ERK/MAPK信號通路調節(jié)小鼠表皮角質形成細胞的生物學功能。
【關鍵詞】：Cdc42 角質形成細胞 皮膚發(fā)育 信號轉導
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R751
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-28
• 第一章 表皮特異性Cdc42基因敲除小鼠模型的建立28-44
• 1.1 材料和儀器28-31
• 1.2 方法31-37
• 1.3 結果37-41
• 1.4 討論41-44
• 第二章 轉基因小鼠重要內臟器官的組織形態(tài)學觀察44-58
• 引言44
• 2.1 材料和儀器44-46
• 2.2 方法46-47
• 2.3 結果47-56
• 2.4 討論56-58
• 第三章 Cdc42基因敲除對小鼠皮膚發(fā)育的影響及其作用機制58-103
• 引言58
• 第一節(jié) 轉基因小鼠在皮膚發(fā)育過程中的組織學觀察58-70
• 3.1 材料和儀器58-59
• 3.2 方法59-61
• 3.3 結果61-66
• 3.4 討論66-70
• 第二節(jié) Cdc42基因敲除對角質形成細胞生物學功能的影響70-96
• 3.1 材料和儀器70-72
• 3.2 方法72-77
• 3.3 結果77-85
• 3.4 討論85-96
• 第三節(jié) Cdc42在小鼠皮膚發(fā)育過程中的作用機制96-103
• 3.1 材料和儀器96
• 3.2 方法96-97
• 3.3 結果97-99
• 3.4 討論99-103
• 全文小結103-105
• 參考文獻105-112
• 中英文縮略詞表112-114
• 攻讀學位期間成果114-115
• 致謝115-118
• 統(tǒng)計學證明118

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本文編號：640022