本文關(guān)鍵詞：CD147與NDUFS6結(jié)合對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞線粒體功能和凋亡的影響

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【摘要】：研究背景 惡性黑素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤,預(yù)后差,極易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。其生長(zhǎng)旺盛、分裂增殖速度快,并擁有腫瘤的典型特征-能量代謝異常,這其中包括氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)的改變。OXPHOS主要是由線粒體電子呼吸鏈復(fù)合物完成,是細(xì)胞高效的產(chǎn)能過程,與腫瘤生長(zhǎng)速度相關(guān),并在轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤細(xì)胞中水平升高。 CD147/Basigin (BSG)是一種高糖基化的跨膜糖蛋白,在包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種代謝活躍的細(xì)胞膜上高表達(dá),可作為分子伴侶與其他一系列蛋白結(jié)合,形成復(fù)合物在炎癥、腫瘤等過程中發(fā)揮重要功能。既往研究表明,CD147與惡性黑素瘤的增殖、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān),而腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移離不開能量代謝,用siRNA技術(shù)干擾CD147的表達(dá)可通過下調(diào)細(xì)胞的糖酵解從而抑制黑素瘤的惡性行為。然而,CD147與OXPHOS的關(guān)系尚未明了。因此,本研究旨在明確CD147是否可與惡性黑素瘤線粒體上相關(guān)蛋白結(jié)合而影響線粒體相關(guān)功能,進(jìn)而調(diào)節(jié)OXPHOS水平,參與腫瘤能量代謝。 研究目的 1.研究CD147在原位和轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤組織中的表達(dá)位置； 2.探討CD147在惡性黑素瘤細(xì)胞線粒體上的表達(dá),進(jìn)而找出其在線粒體上可能的相關(guān)結(jié)合蛋白； 3.探討CD147是否與線粒體上相關(guān)蛋白結(jié)合而影響惡性黑素瘤細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性； 4.探討CD147是否通過線粒體通路對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞活性和凋亡產(chǎn)生影響。 研究方法 1.利用免疫組化方法檢測(cè)10例原位惡性黑素瘤和10例轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤中CD147的表達(dá),分析其表達(dá)位置的差異； 2.分離A375細(xì)胞的線粒體和胞漿蛋白,利用western blot檢測(cè)CD147在A375細(xì)胞線粒體上的表達(dá)； 3.用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)方法明確CD147在A375細(xì)胞線粒體上的定位； 4.采用酵母雙雜交的方法找出CD147在線粒體上的可能結(jié)合蛋白—NDUFS6,構(gòu)建了CD147-Myc和Flag-NDUFS6的質(zhì)粒,并在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn),利用免疫共沉淀和免疫熒光共聚焦法驗(yàn)證兩者之間的結(jié)合; 5.構(gòu)建了分別敲除CD147胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域Ⅰ(Ig domain Ⅰ, delete34-89)、胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域Ⅱ (Ig domain Ⅱ,delete105-199)、跨膜段(Transmembrane domain, delete207-230),胞內(nèi)段(Cytoplasmic domain, delete231-end)及同時(shí)敲除跨膜段和胞內(nèi)段(Transmembrane and Cytoplasmic domains, delete207-end)的質(zhì)粒,均帶有Myc-tag,利用免疫共沉淀法明確CD147與NDUFS6的結(jié)合區(qū)段,并用細(xì)胞免疫熒光共聚焦法進(jìn)一步驗(yàn)證； 6.利用siRNA技術(shù)干擾A375細(xì)胞中CD147的表達(dá),用免疫印跡法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的有效性,將正常對(duì)照(normal control)和干擾CD147的A375細(xì)胞分別命名為A375-siNC和A375-siCD147[或A375-siBSG); 7.利用Dipstick試劑盒檢測(cè)A375-siNC和A375-siCD147細(xì)胞中線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性； 8.用線粒體損傷藥物黃連素處理A375-siNC和A375-siCD147細(xì)胞,用Alamar Blue法檢測(cè)細(xì)胞活性； 9.用黃連素處理A375-siNC和A375-siCD147細(xì)胞,檢測(cè)凋亡水平(免疫印跡法檢測(cè)Cleaved-PARP表達(dá)); 10.在A375-siNC和A375-siCD147細(xì)胞中過表達(dá)Bcl-2,用黃連素處理細(xì)胞,檢測(cè)凋亡水平(免疫印跡法檢測(cè)Cleaved-PARP表達(dá))。 研究結(jié)果 1.在20例標(biāo)本中,黑素瘤細(xì)胞膜上均有不同程度的CD147的表達(dá),而在2例原位癌和8例轉(zhuǎn)移癌中出現(xiàn)明顯的胞漿分布; 2.CD147在A375細(xì)胞的線粒體中有高表達(dá),并與ATP5B在線粒體上存在共定位； 3.酵母雙雜交篩選出NDUFS6可能作為CD147潛在的結(jié)合蛋白。 4.用免疫共沉淀方法檢測(cè)到CD147與NDUFS6存在相互作用,免疫熒光共聚焦檢測(cè)到二者在A375細(xì)胞中有共定位； 5.用Flag抗體沉淀含不同缺失區(qū)段的CD147-Myc,檢測(cè)到敲除了CD147胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域I和敲除跨膜段后與NDUFS6無結(jié)合；提示這兩個(gè)區(qū)段可能為二者結(jié)合部位,免疫熒光共聚焦共定位結(jié)果與之一致； 6. CD147siRNA的2個(gè)不同干擾位點(diǎn)分別下調(diào)了A375細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性25.1%和27.8%(P0.05)； 7. CD147siRNA顯著降低了黃連素處理后的A375細(xì)胞活性(P0.01); 8. CD147siRNA上調(diào)了黃連素引起的A375細(xì)胞中Cleaved-PARP的表達(dá)水平,在A375-siNC和A375-siCD147細(xì)胞中加入外源性的Bcl-2可保護(hù)黃連素引起的凋亡。 結(jié)論 1.CD147在轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤中有向胞漿轉(zhuǎn)位的趨勢(shì)； 2.CD147在惡性黑素瘤A375細(xì)胞線粒體上與NDUFS6相互作用,影響線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性,進(jìn)而可能參與惡性黑素瘤能量代謝的OXPHOS過程；3.CD147可能通過線粒體途徑增強(qiáng)A375細(xì)胞活性,減少其凋亡。
【關(guān)鍵詞】：CD147 Complex Ⅰ活性 細(xì)胞凋亡 惡性黑素瘤 黃連素 NDUFS6 線粒體
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 縮略語表14-16
• 前言16-18
• 第一章 材料與方法18-36
• 1.1 試劑和耗材18-21
• 1.1.1 主要試劑18-20
• 1.1.2 主要耗材20-21
• 1.2 主要儀器21-22
• 1.3 主要試劑的配制22-24
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法24-35
• 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 1.4.2 組織芯片的免疫組化25-26
• 1.4.3 線粒體與胞漿蛋白提取及免疫印跡檢測(cè)蛋白水平26-27
• 1.4.4 酵母雙雜交27-28
• 1.4.5 分子克隆與PCR28-32
• 1.4.6 細(xì)胞免疫熒光32-33
• 1.4.7 小干擾RNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染33
• 1.4.8 免疫共沉淀33-34
• 1.4.9 線粒體電子呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性檢測(cè)34-35
• 1.4.10 細(xì)胞活力測(cè)定35
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35-36
• 第二章 結(jié)果36-46
• 2.1 CD147在原位和轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤組織中的表達(dá)36
• 2.2 CD147在A375細(xì)胞線粒體中的表達(dá)36-37
• 2.2.1 A375細(xì)胞線粒體蛋白和胞漿蛋白中CD147的表達(dá)36-37
• 2.2.2 CD147與ATP5B在A375細(xì)胞線粒體上共定位37
• 2.3 CD147在線粒體上的可能結(jié)合蛋白的篩選與鑒定37-39
• 2.3.1 篩選CD147的可能結(jié)合蛋白37-38
• 2.3.2 在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)CD147和NDUFS638
• 2.3.3 免疫共沉淀驗(yàn)證CD147與NDUFS6的特異性結(jié)合38-39
• 2.3.4 細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證CD147與NDUFS6的共定位39
• 2.4 明確CD147與NDUFS6的結(jié)合區(qū)段39-41
• 2.4.1 將敲除了不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的CD147-Myc質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中與Flag-NDUFS6質(zhì)粒共轉(zhuǎn),免疫共沉淀找出結(jié)合區(qū)段39-40
• 2.4.2 細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證CD147與NDUFS6的結(jié)合區(qū)段40-41
• 2.5 CD147SIRNA對(duì)線粒體電子呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ活性的影響41-43
• 2.5.1 線粒體復(fù)合物Ⅰ活性標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作41-42
• 2.5.2 A375細(xì)胞中用siRNA干擾CD147的表達(dá)42
• 2.5.3 CD147 siRNA對(duì)A375細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ活性的影響42-43
• 2.6 CD147sIRNA對(duì)黃連素處理的A375細(xì)胞活力的影響43-44
• 2.7 CD147sIRNA對(duì)黃連素引起的A375細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響44-46
• 2.7.1 CD147siRNA增加了黃連素引起的A375細(xì)胞凋亡44-45
• 2.7.2 CD147siRNA通過線粒體途徑增加了黃連素引起的A375細(xì)胞凋亡45-46
• 第三章 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 綜述56-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果69

【共引文獻(xiàn)】

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