本文關(guān)鍵詞：靶向黑色素瘤重組免疫毒素MSH-PE38KDEL的表達(dá)、純化及其靶向抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)

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【摘要】：惡性黑色素瘤是惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的一種，目前仍沒有找到治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤最為有效的方法。重組毒素由于具有特異性高、細(xì)胞毒性強(qiáng)的特點(diǎn)，有望成為黑色素瘤（輔助）治療的有效方法之一，特別是對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療可能是最好的方式。本研究利用惡性黑色素瘤細(xì)胞表面MC1R的結(jié)合位點(diǎn)為正常細(xì)胞及其它腫瘤的幾十倍的巨大差異，并利用促黑色素細(xì)胞激素(Melanophore-stimulating hormone, α-MSH)可特異性的與惡性黑色素瘤表面的MC1R結(jié)合的特性，將α-MSH作為惡性黑色素瘤特異的靶向載體；將綠膿桿菌外毒素PE作為免疫毒素的毒性部分用于殺傷靶細(xì)胞，構(gòu)建了重組毒素MSH-PE38KDEL，以基因工程方式表達(dá)黑色素瘤靶向免疫毒素。 重組毒素MSH-PE38KDEL的構(gòu)建與表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)分析，優(yōu)化MSH與PE40的鏈接Linker，確保各自的結(jié)構(gòu)與功能不受影響；然后對PE40進(jìn)行修飾，降低其免疫原性（PE38），并增加其活性（PE38KDEL）；構(gòu)建了MSH-PE38KDEL基因，將其連接到pET28a、pHis1525表達(dá)載體上，構(gòu)建了pET28a-MSH-PE38KDEL、 pHis1525-MSH-PE38KDEL重組質(zhì)粒，分別在Rosegami、WH320表達(dá)宿主菌內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析及活性測定，最終篩選了高表達(dá)且具有生物活性的重組質(zhì)粒pET28a-MSH-PE38KDEL。將序列鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Rosetta-gamiTM2(DE3)，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。以SDS-PAGE對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。同時(shí)用凝膠成像分析系統(tǒng)配套軟件對MSH-PE38KDEL融合蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析，證明其表達(dá)量可占全菌體的10%。 重組毒素MSH-PE38KDEL的純化。利用Western blot對超聲破碎后菌體進(jìn)行分析證明融合蛋白為可溶性表達(dá)。對表達(dá)后蛋白采用了菌體超聲破碎、離心、疏水層析、離子交換及分子篩層析等純化手段， SDS-PAGE分析MSH-PE38KDEL的純度，，其純度可達(dá)90%以上。 重組毒素MSH-PE38KDEL的體外抗黑色素瘤活性。采用α-MSH受體高表達(dá)的人黑色素瘤A875細(xì)胞及鼠黑色素瘤B16細(xì)胞進(jìn)行了體外生物活性試驗(yàn)，同時(shí)以α-MSH受體低表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE、乳腺癌細(xì)胞MCF及人正常細(xì)胞2BS做對照，證明其靶向殺傷作用。MTT檢測MSH-PE38KDEL對黑色素瘤細(xì)胞A875及B16的殺傷作用在85%以上，而對人正常細(xì)胞2BS無殺傷作用。 重組毒素MSH-PE38KDEL的體內(nèi)抗黑色素瘤活性。以鼠黑色素瘤B16細(xì)胞在NIH/nu裸鼠體內(nèi)建立黑色素瘤高轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。采用了瘤周圍注射及靜脈注射兩種給藥途徑，對荷瘤小鼠進(jìn)行治療。結(jié)果顯示以MSH-PE38KDEL1.1mg/只連續(xù)注射10天，可顯著抑制腫瘤生長，其抑瘤率＞90%，且瘤周注射組腫瘤消失率為30%，靜脈注射組腫瘤消失率為40%。病理切片HE染色結(jié)果顯示MSH-PE38KDEL有效抑制了黑色素瘤B16細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移；電鏡觀察肝臟超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，MSH-PE38KDEL抑制了黑色素瘤B16細(xì)胞對機(jī)體細(xì)胞的破壞作用。重組毒素MSH-PE38KDEL在體內(nèi)具有明顯的抗黑色素瘤的效應(yīng)，毒副作用低，病理及電鏡結(jié)果顯示對實(shí)質(zhì)臟器均未見損傷。MSH-PE38KDEL有望成為靶向治療黑色素瘤的候選藥物。
【關(guān)鍵詞】：重組免疫毒素 MSH-PE38KDEL 黑色素瘤 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞表11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-45
• 第1章 黑色素瘤研究進(jìn)展13-19
• 1.1 我國黑色素瘤發(fā)生情況13-14
• 1.2 惡性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移途徑及發(fā)生機(jī)制14-15
• 1.3 黑色素瘤的治療15-17
• 1.4 免疫毒素用于黑色素瘤治療的展望17-19
• 第2章 免疫毒素的研究進(jìn)展19-29
• 2.1 免疫毒素的概念及策略19-20
• 2.2 免疫毒素的研究歷程20-22
• 2.3 重組免疫毒素靶向分子的選擇22-24
• 2.4 重組免疫毒素毒素配體的設(shè)計(jì)及作用機(jī)制24-25
• 2.5 重組免疫毒素在腫瘤治療中的研究25-27
• 2.6 重組免疫毒素治療實(shí)體瘤的研究進(jìn)展27-28
• 2.7 重組免疫毒素研發(fā)及應(yīng)用的瓶頸28-29
• 第3章 PE 類重組免疫毒素的研究進(jìn)展29-37
• 3.1 PE 的結(jié)構(gòu)與功能29-30
• 3.2 PE 的細(xì)胞毒性機(jī)制30-31
• 3.3 PE 衍生物31-32
• 3.4 PE 衍生物基因重組免疫毒素的研究進(jìn)展32-34
• 3.5 PE 類毒素在腫瘤導(dǎo)向中的應(yīng)用34-37
• 第4章 促黑色素細(xì)胞激素及其受體研究進(jìn)展37-45
• 4.1 促黑色素細(xì)胞激素及其受體37-40
• 4.2 以促黑色素細(xì)胞激素為靶向載體的重組毒素的研究進(jìn)展40
• 4.3 促黑色素細(xì)胞激素及其受體在人類疾病中的作用40-43
• 4.4 促黑色素細(xì)胞激素為導(dǎo)向的研究策略43-45
• 第二篇 研究內(nèi)容45-145
• 第1章 MSH-PE38KDEL 在巨大芽孢桿菌中的表達(dá)及活性測定45-67
• 1.1 材料與方法46-58
• 1.2 結(jié)果58-62
• 1.3 討論62-65
• 1.4 小結(jié)65-67
• 第2章 MSH-PE38KDEL 在大腸桿菌中的表達(dá)及活性測定67-81
• 2.1 材料與方法67-74
• 2.2 結(jié)果74-78
• 2.3 討論78-79
• 2.4 小結(jié)79-81
• 第3章 MSH-PE38KDEL 的表達(dá)、純化及鑒定81-95
• 3.1 材料與方法81-87
• 3.2 結(jié)果87-91
• 3.3 討論91-93
• 3.4 小結(jié)93-95
• 第4章 MSH-PE38KDEL 對黑色素瘤細(xì)胞生長的抑制作用95-109
• 4.1 材料與方法95-98
• 4.2 結(jié)果98-104
• 4.3 討論104-107
• 4.4 小結(jié)107-109
• 第5章 MSH-PE38KDEL 對鼠黑色素瘤模型的治療試驗(yàn)109-145
• 5.1 材料與方法109-115
• 5.2 結(jié)果115-140
• 5.3 討論140-144
• 5.4 小結(jié)144-145
• 結(jié)論145-147
• 參考文獻(xiàn)147-167
• 導(dǎo)師簡介167-169
• 作者簡介169-171
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的成果171-173
• 致謝173

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：552819