本文關(guān)鍵詞：POU4F1在黑素瘤中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景黑素瘤是一種起源于黑素細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤,具有惡性程度高、死亡率高等特點(diǎn)。近年來(lái),黑素瘤在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì),已經(jīng)是歐美地區(qū)發(fā)病率增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一。我國(guó)屬黑素瘤發(fā)病率較低地區(qū),但由于我國(guó)人口基數(shù)大黑素瘤患者人數(shù)眾多,并且我國(guó)黑素瘤發(fā)病率也處于持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài),因此對(duì)黑素瘤進(jìn)行深入的分子機(jī)制研究對(duì)提高黑素瘤的診療效果、提高國(guó)民健康水平具有重要意義。根據(jù)以往研究,多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子參與了黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。BRAF和NRAS是MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白激酶,在超過(guò)50%的黑素瘤病例中存在活化性基因突變,突變的BRAF和NRAS基因使MAPK通路過(guò)度激活促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖。PI3K通路中的抑制分子PTEN在黑素瘤中存在較高頻率的失活突變,突變的PTEN喪失對(duì)PI3K通路的抑制活性,從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖。此外,較多研究證實(shí)起源于外胚層神經(jīng)嵴細(xì)胞的黑素細(xì)胞在其惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增加。MITF是胚胎發(fā)育過(guò)程中促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞分化為黑素細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子,在部分黑素瘤患者腫瘤組織中高表達(dá)并發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用;神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關(guān)的SOX家族多種轉(zhuǎn)錄因子,如SOX2、SOX4、SOX9等均參與到黑素瘤細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等過(guò)程。近年研究發(fā)現(xiàn),主要表達(dá)于胚胎早期神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的POU家族轉(zhuǎn)錄因子,如POU5F1、POU3F2等,在黑素瘤組織及細(xì)胞系中高表達(dá)并發(fā)揮促腫瘤作用。POU4F1是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要分子,在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)于中樞神經(jīng)前體細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控Bcl-2基因的表達(dá),并可與P53蛋白發(fā)生蛋白質(zhì)間相互作用調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。通過(guò)以上作用,轉(zhuǎn)錄因子POU4F1可發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)分化和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)POU4F1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,黑素瘤中POU4F1可保護(hù)細(xì)胞基因組DNA并降低DNA損傷程度,逆轉(zhuǎn)由于BRAF突變導(dǎo)致的細(xì)胞衰老現(xiàn)象,從而促進(jìn)黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是目前尚缺少黑素瘤中轉(zhuǎn)錄因子POU4F1作用的全面研究,且POU4F1在黑素瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。因此,本課題旨在全面地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用,并對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。研究方法1.使用Real-time PCR對(duì)原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系,以及色素痣組織和黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平表達(dá)量的檢測(cè)。2.通過(guò)Western blot檢測(cè)POU4F1在原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系以及色素痣組織和黑素瘤組織中的蛋白表達(dá)水平。3.使用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將POU4F1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hs 294T和A2058細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞過(guò)表達(dá)POU4F14.CCK8試劑對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞染色,比較POU4F1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量的差異。5.AnexinⅤ-FITC和PI染色體系對(duì)POU4F1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。6.Western blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)POU4F1細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK的含量。7.使用克隆形成實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)POU4F1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)兩周后細(xì)胞克隆數(shù)進(jìn)行比較,并分析兩組在ERK劑作用下細(xì)胞克隆形成數(shù)量的差異。研究結(jié)果1.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)各細(xì)胞系及組織中均存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),且mRNA水平與蛋白水平表達(dá)水平一致。細(xì)胞系中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:中原代黑素細(xì)胞和黑素細(xì)胞系中POU4F1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量較低,而黑素瘤細(xì)胞系中POU4F1表達(dá)量較高;組織中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:黑素瘤組織中POU4F1蛋白表達(dá)量顯著高于色素痣組織(n=8,P0.05)。2.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤細(xì)胞中的作用POU4F1低表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞可外源地提高POU4F1的表達(dá)(約2.3倍,P0.05)。過(guò)表達(dá)POU4F1的黑素瘤細(xì)胞相較于對(duì)照組,細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后第72小時(shí)和第96小時(shí),細(xì)胞數(shù)量均明顯增高(P0.001)。凋亡水平檢測(cè)結(jié)果顯示:在H2O2刺激下,過(guò)表達(dá)POU4F1組細(xì)胞凋亡水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(過(guò)表達(dá)組33.8%±1.25%,對(duì)照組20.2%±0.83%,P0.01)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示:過(guò)表達(dá)POU4F1對(duì)黑素瘤細(xì)胞的遷移能力無(wú)顯著影響(過(guò)表達(dá)組135.7±6.8,對(duì)照組124±9.8,P0.05)。3.轉(zhuǎn)錄因子POU4F1促黑素瘤細(xì)胞增殖機(jī)制的初步探討過(guò)表達(dá)POU4F1的黑素瘤細(xì)胞內(nèi),ERK的磷酸化水平顯著增高(約3.5倍,P0.01)�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)POU4F1組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著高于對(duì)照組(過(guò)表達(dá)組為542±3.4,對(duì)照組為304±3.9,P0.001);過(guò)表達(dá)POU4F1的細(xì)胞給予ERK抑制劑處理后,細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低(過(guò)表達(dá)組為542±3.4,過(guò)表達(dá)+抑制劑組為126±2.6,P0.001)。ERK上游激酶MAP2K2基因啟動(dòng)子區(qū)存在POU4F1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),并且POU4F1過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)MAP2K2的mRNA和蛋白水平均升高。研究結(jié)論通過(guò)以上研究,我們證實(shí)POU4F1在黑素瘤中表達(dá)量高于原代黑素細(xì)胞及色素痣組織,并首次在黑素瘤細(xì)胞中明確了POU4F1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡的作用。針對(duì)POU4F1的促腫瘤增殖作用,我們進(jìn)一步探討了POU4F1對(duì)ERK活性的激活作用,提示POU4F1通過(guò)激活ERK活性促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子POU4F1過(guò)表達(dá)可能對(duì)MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白激酶MAP2K2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,黑素瘤中高表達(dá)的POU4F1可能通過(guò)促進(jìn)MAP2K2蛋白的表達(dá)激活下游ERK分子,從而增強(qiáng)MAPK通路的活性促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖。我們的研究首次證實(shí)了POU4F1具有促進(jìn)MAPK通路激活的作用,這一作用參與了黑素瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程,并在黑素瘤耐藥機(jī)制中可能發(fā)揮重要功能,這為黑素瘤BRAF靶點(diǎn)治療的耐藥機(jī)制提供了新的研究方向。
【關(guān)鍵詞】：黑素瘤 轉(zhuǎn)錄因子 POU4F1 MAPK通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 前言16-17
• 文獻(xiàn)回顧17-28
• 第一部分 轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)及意義28-42
• 1 材料28-32
• 1.1 主要儀器28-29
• 1.2 主要試劑29-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配方30-32
• 1.4 研究對(duì)象32
• 1.5 其他材料32
• 2 方法32-38
• 2.1 原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系、色素痣組織以及惡性黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平的檢測(cè)32-36
• 2.2 原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系、色素痣組織以及惡性黑素瘤組織中POU4F1蛋白水平的檢測(cè)36-38
• 3 結(jié)果38-40
• 3.1 Real-time PCR檢測(cè)POU4F1在原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系中mRNA水平的表達(dá)量38
• 3.2 Western blot檢測(cè)POU4F1在原代黑素細(xì)胞、黑素細(xì)胞細(xì)胞系、黑素瘤細(xì)胞系中蛋白水平的表達(dá)量38-39
• 3.3 Real-time PCR檢測(cè)POU4F1在色素痣組織和惡性黑素瘤組織中mRNA水平的表達(dá)量39-40
• 3.4 Western blot檢測(cè)POU4F1在色素痣組織和惡性黑素瘤組織中蛋白水平的表達(dá)量40
• 4 討論40-42
• 第二部分 轉(zhuǎn)錄因子POU4F1在黑素瘤細(xì)胞中的作用研究42-55
• 1 材料42-47
• 1.1 主要儀器42-43
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑43-44
• 1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配方44-46
• 1.4 研究對(duì)象46
• 1.5 其他材料46-47
• 2 方法47-50
• 2.1 細(xì)胞系培養(yǎng)47
• 2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化47
• 2.3 質(zhì)粒擴(kuò)增及提取47-48
• 2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48
• 2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)48
• 2.6 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ki67表達(dá)48-49
• 2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)49
• 2.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)49-50
• 3 結(jié)果50-53
• 3.1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)黑素瘤Hs294T和A2058細(xì)胞系中POU4F1表達(dá)的影響50-51
• 3.2 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)黑素瘤Hs 294T和A2058細(xì)胞增殖的影響51-52
• 3.3 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)黑素瘤Hs 294T和A2058細(xì)胞凋亡的影響52-53
• 3.4 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)黑素瘤Hs 294T和A2058細(xì)胞遷移的影響53
• 4 討論53-55
• 第三部分 轉(zhuǎn)錄因子POU4F1促黑素瘤細(xì)胞增殖機(jī)制的初步探討55-66
• 1 材料55-59
• 1.1 主要儀器設(shè)備55-56
• 1.2 主要試劑56-57
• 1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配方57-59
• 1.4 其他材料59
• 2 方法59-60
• 2.1 ERK抑制劑溶解方法59
• 2.2 Western blot檢測(cè)蛋白水平表達(dá)量59-60
• 2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)60
• 3 結(jié)果60-64
• 3.1 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)MAPK通路中ERK活性的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)60-61
• 3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ERK抑制劑對(duì)POU4F1促增殖作用的影響61-62
• 3.3 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)MAPK通路關(guān)鍵基因mRNA水平的影響62-63
• 3.4 POU4F1過(guò)表達(dá)對(duì)MAP2K2基因蛋白水平的影響63
• 3.5 MAP2K2基因啟動(dòng)子區(qū)POU4F1結(jié)合位點(diǎn)63-64
• 4 討論64-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果73-74
• 致謝74

，

本文編號(hào)：534176