本文關鍵詞：POU4F1在黑素瘤中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景黑素瘤是一種起源于黑素細胞的皮膚惡性腫瘤,具有惡性程度高、死亡率高等特點。近年來,黑素瘤在全球范圍內發(fā)病率呈快速增長趨勢,已經(jīng)是歐美地區(qū)發(fā)病率增長速度最快的惡性腫瘤之一。我國屬黑素瘤發(fā)病率較低地區(qū),但由于我國人口基數(shù)大黑素瘤患者人數(shù)眾多,并且我國黑素瘤發(fā)病率也處于持續(xù)增長狀態(tài),因此對黑素瘤進行深入的分子機制研究對提高黑素瘤的診療效果、提高國民健康水平具有重要意義。根據(jù)以往研究,多種信號轉導通路中的重要分子參與了黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。BRAF和NRAS是MAPK通路中的關鍵蛋白激酶,在超過50%的黑素瘤病例中存在活化性基因突變,突變的BRAF和NRAS基因使MAPK通路過度激活促進黑素瘤細胞的增殖。PI3K通路中的抑制分子PTEN在黑素瘤中存在較高頻率的失活突變,突變的PTEN喪失對PI3K通路的抑制活性,從而促進黑素瘤細胞增殖。此外,較多研究證實起源于外胚層神經(jīng)嵴細胞的黑素細胞在其惡性轉化過程中神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關的轉錄因子表達量增加。MITF是胚胎發(fā)育過程中促進神經(jīng)嵴細胞分化為黑素細胞的重要轉錄因子,在部分黑素瘤患者腫瘤組織中高表達并發(fā)揮促進細胞增殖的作用;神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育相關的SOX家族多種轉錄因子,如SOX2、SOX4、SOX9等均參與到黑素瘤細胞增殖、凋亡及轉移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn),主要表達于胚胎早期神經(jīng)細胞內的POU家族轉錄因子,如POU5F1、POU3F2等,在黑素瘤組織及細胞系中高表達并發(fā)揮促腫瘤作用。POU4F1是POU轉錄因子家族中的重要分子,在胚胎發(fā)育的早期表達于中樞神經(jīng)前體細胞。轉錄因子POU4F1可與Bcl-2基因啟動子區(qū)結合調控Bcl-2基因的表達,并可與P53蛋白發(fā)生蛋白質間相互作用調控其轉錄活性。通過以上作用,轉錄因子POU4F1可發(fā)揮促進神經(jīng)系統(tǒng)分化和抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)POU4F1具有促進細胞增殖的作用,黑素瘤中POU4F1可保護細胞基因組DNA并降低DNA損傷程度,逆轉由于BRAF突變導致的細胞衰老現(xiàn)象,從而促進黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是目前尚缺少黑素瘤中轉錄因子POU4F1作用的全面研究,且POU4F1在黑素瘤細胞中的作用機制尚不清楚。因此,本課題旨在全面地檢測轉錄因子POU4F1在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用,并對其作用機制做進一步的研究。研究方法1.使用Real-time PCR對原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系,以及色素痣組織和黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平表達量的檢測。2.通過Western blot檢測POU4F1在原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系以及色素痣組織和黑素瘤組織中的蛋白表達水平。3.使用lipo3000轉染試劑將POU4F1質粒轉染入Hs 294T和A2058細胞內,使細胞過表達POU4F14.CCK8試劑對不同生長時間點的細胞染色,比較POU4F1過表達組與對照組細胞生長數(shù)量的差異。5.AnexinⅤ-FITC和PI染色體系對POU4F1過表達組與對照組細胞進行標記,流式細胞術檢測各組細胞中凋亡細胞的數(shù)量。6.Western blot技術檢測過表達POU4F1細胞內磷酸化ERK的含量。7.使用克隆形成實驗技術,對POU4F1過表達組與對照組細胞生長兩周后細胞克隆數(shù)進行比較,并分析兩組在ERK劑作用下細胞克隆形成數(shù)量的差異。研究結果1.轉錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細胞系和組織中的表達各細胞系及組織中均存在POU4F1轉錄因子的表達,且mRNA水平與蛋白水平表達水平一致。細胞系中實驗結果顯示:中原代黑素細胞和黑素細胞系中POU4F1轉錄因子的表達量較低,而黑素瘤細胞系中POU4F1表達量較高;組織中實驗結果顯示:黑素瘤組織中POU4F1蛋白表達量顯著高于色素痣組織(n=8,P0.05)。2.轉錄因子POU4F1在黑素瘤細胞中的作用POU4F1低表達的黑素瘤細胞可外源地提高POU4F1的表達(約2.3倍,P0.05)。過表達POU4F1的黑素瘤細胞相較于對照組,細胞在轉染過表達質粒后第72小時和第96小時,細胞數(shù)量均明顯增高(P0.001)。凋亡水平檢測結果顯示:在H2O2刺激下,過表達POU4F1組細胞凋亡水平顯著低于對照組細胞(過表達組33.8%±1.25%,對照組20.2%±0.83%,P0.01)。細胞遷移實驗結果示:過表達POU4F1對黑素瘤細胞的遷移能力無顯著影響(過表達組135.7±6.8,對照組124±9.8,P0.05)。3.轉錄因子POU4F1促黑素瘤細胞增殖機制的初步探討過表達POU4F1的黑素瘤細胞內,ERK的磷酸化水平顯著增高(約3.5倍,P0.01)�？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示:過表達POU4F1組細胞克隆形成數(shù)顯著高于對照組(過表達組為542±3.4,對照組為304±3.9,P0.001);過表達POU4F1的細胞給予ERK抑制劑處理后,細胞克隆數(shù)顯著降低(過表達組為542±3.4,過表達+抑制劑組為126±2.6,P0.001)。ERK上游激酶MAP2K2基因啟動子區(qū)存在POU4F1轉錄因子結合位點,并且POU4F1過表達細胞內MAP2K2的mRNA和蛋白水平均升高。研究結論通過以上研究,我們證實POU4F1在黑素瘤中表達量高于原代黑素細胞及色素痣組織,并首次在黑素瘤細胞中明確了POU4F1具有促進細胞增殖并抑制細胞凋亡的作用。針對POU4F1的促腫瘤增殖作用,我們進一步探討了POU4F1對ERK活性的激活作用,提示POU4F1通過激活ERK活性促進黑素瘤細胞增殖。轉錄因子POU4F1過表達可能對MAPK通路中的關鍵蛋白激酶MAP2K2具有轉錄調控作用,黑素瘤中高表達的POU4F1可能通過促進MAP2K2蛋白的表達激活下游ERK分子,從而增強MAPK通路的活性促進黑素瘤細胞的增殖。我們的研究首次證實了POU4F1具有促進MAPK通路激活的作用,這一作用參與了黑素瘤細胞的增殖過程,并在黑素瘤耐藥機制中可能發(fā)揮重要功能,這為黑素瘤BRAF靶點治療的耐藥機制提供了新的研究方向。
【關鍵詞】：黑素瘤 轉錄因子 POU4F1 MAPK通路
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 前言16-17
• 文獻回顧17-28
• 第一部分 轉錄因子POU4F1在惡性黑素瘤細胞系和組織中的表達及意義28-42
• 1 材料28-32
• 1.1 主要儀器28-29
• 1.2 主要試劑29-30
• 1.3 實驗溶液配方30-32
• 1.4 研究對象32
• 1.5 其他材料32
• 2 方法32-38
• 2.1 原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系、色素痣組織以及惡性黑素瘤組織中POU4F1 mRNA水平的檢測32-36
• 2.2 原代黑素細胞、黑素細胞系、黑素瘤細胞系、色素痣組織以及惡性黑素瘤組織中POU4F1蛋白水平的檢測36-38
• 3 結果38-40
• 3.1 Real-time PCR檢測POU4F1在原代黑素細胞、黑素細胞細胞系、黑素瘤細胞系中mRNA水平的表達量38
• 3.2 Western blot檢測POU4F1在原代黑素細胞、黑素細胞細胞系、黑素瘤細胞系中蛋白水平的表達量38-39
• 3.3 Real-time PCR檢測POU4F1在色素痣組織和惡性黑素瘤組織中mRNA水平的表達量39-40
• 3.4 Western blot檢測POU4F1在色素痣組織和惡性黑素瘤組織中蛋白水平的表達量40
• 4 討論40-42
• 第二部分 轉錄因子POU4F1在黑素瘤細胞中的作用研究42-55
• 1 材料42-47
• 1.1 主要儀器42-43
• 1.2 主要實驗試劑43-44
• 1.3 實驗溶液配方44-46
• 1.4 研究對象46
• 1.5 其他材料46-47
• 2 方法47-50
• 2.1 細胞系培養(yǎng)47
• 2.2 質粒轉化47
• 2.3 質粒擴增及提取47-48
• 2.4 質粒轉染48
• 2.5 細胞增殖檢測48
• 2.6 免疫熒光檢測細胞內Ki67表達48-49
• 2.7 細胞凋亡檢測49
• 2.8 細胞遷移實驗49-50
• 3 結果50-53
• 3.1 過表達質粒轉染對黑素瘤Hs294T和A2058細胞系中POU4F1表達的影響50-51
• 3.2 POU4F1過表達對黑素瘤Hs 294T和A2058細胞增殖的影響51-52
• 3.3 POU4F1過表達對黑素瘤Hs 294T和A2058細胞凋亡的影響52-53
• 3.4 POU4F1過表達對黑素瘤Hs 294T和A2058細胞遷移的影響53
• 4 討論53-55
• 第三部分 轉錄因子POU4F1促黑素瘤細胞增殖機制的初步探討55-66
• 1 材料55-59
• 1.1 主要儀器設備55-56
• 1.2 主要試劑56-57
• 1.3 實驗溶液配方57-59
• 1.4 其他材料59
• 2 方法59-60
• 2.1 ERK抑制劑溶解方法59
• 2.2 Western blot檢測蛋白水平表達量59-60
• 2.3 克隆形成實驗60
• 3 結果60-64
• 3.1 POU4F1過表達對MAPK通路中ERK活性的影響克隆形成實驗60-61
• 3.2 克隆形成實驗檢測ERK抑制劑對POU4F1促增殖作用的影響61-62
• 3.3 POU4F1過表達對MAPK通路關鍵基因mRNA水平的影響62-63
• 3.4 POU4F1過表達對MAP2K2基因蛋白水平的影響63
• 3.5 MAP2K2基因啟動子區(qū)POU4F1結合位點63-64
• 4 討論64-66
• 小結66-67
• 參考文獻67-73
• 個人簡歷和研究成果73-74
• 致謝74

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本文編號：534176