本文關(guān)鍵詞：SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景黑素瘤是來源于黑素細胞的具有高度侵襲性的皮膚惡性腫瘤,早期診斷并行手術(shù)切除的黑素瘤預(yù)后良好,而中晚期黑素瘤預(yù)后差,致死率高,嚴(yán)重危害我國人民健康及生活質(zhì)量。目前已發(fā)現(xiàn)黑素瘤是多因素、多階段、多種分子事件共同作用導(dǎo)致的惡性疾病,其中異�；钚缘霓D(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控下游靶基因而引起細胞下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變,繼發(fā)性影響細胞增殖與凋亡,侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,最終造成黑素細胞的惡性轉(zhuǎn)化。然而現(xiàn)有的分子機制研究尚不足以十分明晰黑素瘤發(fā)生發(fā)展乃至侵襲轉(zhuǎn)移的具體機理。因此,探索黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制,并進一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療,對降低黑素瘤患者死亡率和改善黑素瘤患者預(yù)后具有顯著意義。SOX家族為一類調(diào)控組織特異性、器官發(fā)育、細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子,可以通過轉(zhuǎn)錄水平激活或抑制下游基因及通路,參與并調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移行為。SOX4屬于SOX C亞家族成員,不僅在維持細胞干性,促進骨及神經(jīng)組織正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用,還在多種惡性腫瘤中異常表達且與腫瘤患者的預(yù)后及生存期相關(guān)。越來越多的研究顯示,SOX4可以通過影響細胞增殖,周期,凋亡等過程參與乳腺癌,肝癌,結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且有針對SOX4的T細胞及抗體表位肽研究應(yīng)用于肺癌的疫苗研制,靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達及調(diào)節(jié)其觸發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)可有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這強烈提示SOX4具有成為免疫疫苗靶點及治療腫瘤疾病靶點的巨大潛力。然而,SOX4與其調(diào)控的下游靶基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的詳盡作用及具體機制尚不明確。闡明SOX4在黑素瘤發(fā)病機制中的具體作用,并探討挖掘其治療潛能,可為靶向治療黑素瘤及研制黑素瘤疫苗提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。本課題擬通過檢測轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤,原發(fā)黑素瘤,色素痣以及黑素瘤細胞系中的表達水平,并從分子生物學(xué)水平研究轉(zhuǎn)錄因子SOX4對黑素瘤增殖,侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響,進而闡明SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和具體機制,為黑素瘤臨床診療及預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。研究方法1.Real-time PCR法,western blot方法檢測轉(zhuǎn)錄因子SOX4在色素痣,原發(fā)黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達情況。2.Western blot方法檢測惡性黑素瘤細胞系中SOX4在蛋白水平的表達。3.使用轉(zhuǎn)染試劑將特異靶向SOX4的si RNA轉(zhuǎn)入黑素瘤細胞系A(chǔ)2058,WM35中,降低細胞內(nèi)源性SOX4的表達水平。4.流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡水平以觀察轉(zhuǎn)錄因子SOX4對轉(zhuǎn)染細胞體外生物學(xué)行為的影響。5.建立SOX4慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染細胞系,real-time PCR及western blot方法檢測SOX4水平是否下調(diào),以此判斷細胞系是否建立成功。為下一步深入機制研究奠定基礎(chǔ)。6.在成功建立的SOX4低表達的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中,對EMT的標(biāo)志物E-cadherin進行檢測。研究結(jié)果1.SOX4在黑素瘤組織和黑素瘤細胞系中的表達在RNA水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達水平顯著高于原發(fā)黑素瘤及色素痣,原發(fā)黑素瘤與色素痣中SOX4的表達水平?jīng)]有明顯差異。色素痣中p53的表達水平明顯高于轉(zhuǎn)移性黑素瘤和原發(fā)黑素瘤。Real-time PCR顯示相對瘤旁組織,瘤中心組織的SOX4水平明顯升高。Western blot法檢測顯示在蛋白水平上,原發(fā)黑素瘤及轉(zhuǎn)移性黑素瘤的SOX4表達水平高于色素痣組織,同時多個黑素瘤細胞系都檢測到了轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達,且A2058及WM35細胞系中的表達量最為突出,于是選取此兩種細胞系作為下一步檢測生物學(xué)行為的實驗對象。2.SOX4對黑素瘤細胞生物學(xué)行為的影響瞬時轉(zhuǎn)染SOX4 si RNA后的黑素瘤細胞系A(chǔ)2058及WM35,相比對照組,SOX4表達水平降低,同時黑素瘤細胞的生長速度減慢,G l期進入S期的細胞比例減少,細胞凋亡指數(shù)增加。3.成功構(gòu)建SOX4的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)A2058細胞系,在蛋白及m RNA水平上驗證了SOX4的下調(diào)表達。4.成功建立慢病毒轉(zhuǎn)染A2058細胞系,western blot檢測顯示,當(dāng)SOX4水平降低時,E-cadherin表達水平下降。研究結(jié)論:1.本研究通過檢測發(fā)現(xiàn),在m RNA水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在黑素瘤組織中的表達水平明顯高于原發(fā)黑素瘤組織和色素痣組織,但原發(fā)黑素瘤組織與色素痣組織之間無明顯差異。在蛋白水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織和原發(fā)性黑素瘤組織中的表達水平均明顯高于色素痣組織。得出結(jié)論,SOX4參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。2.通過黑素瘤細胞系A(chǔ)2058及WM35瞬時轉(zhuǎn)染SOX4 si RNA的實驗,在m RNA及蛋白水平上證實SOX4表達水平降低后,進行細胞流式實驗。結(jié)果顯示:相比陰性對照組,SOX4 si RNA組的黑素瘤細胞生長速度減慢,G l期進入S期的細胞比例減少,細胞凋亡指數(shù)增加。這說明轉(zhuǎn)錄因子SOX4可以抑制黑素瘤細胞的凋亡,使G l期進入S期的細胞比例增加,加強黑素瘤細胞的增殖能力。3.成功建立SOX4低表達的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系A(chǔ)2058,并檢測該細胞系EMT相關(guān)基因E-cadherin的表達情況。在蛋白水平上證明了轉(zhuǎn)錄因子SOX4與E-cadherin呈正相關(guān)性。說明SOX4可能通過EMT相關(guān)蛋白分子促進黑素瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：黑素瘤 轉(zhuǎn)錄因子 SOX4 EMT 侵襲轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-24
• 實驗一 轉(zhuǎn)錄因子SOX4在惡性黑素瘤組織和細胞中的表達及意義24-36
• 1 材料24-29
• 2 方法29-32
• 3 結(jié)果32-34
• 4 討論34-36
• 實驗二 轉(zhuǎn)錄因子SOX4對黑素瘤細胞周期及凋亡的影響36-46
• 1 材料36-40
• 2 方法40-42
• 3 結(jié)果42-45
• 4 討論45-46
• 實驗三 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立，鑒定及黑素瘤發(fā)病機制的初步探討46-52
• 1 材料46
• 2 方法46-48
• 3 結(jié)果48-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻53-58
• 個人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

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本文編號：482675