本文關(guān)鍵詞：SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景黑素瘤是來(lái)源于黑素細(xì)胞的具有高度侵襲性的皮膚惡性腫瘤,早期診斷并行手術(shù)切除的黑素瘤預(yù)后良好,而中晚期黑素瘤預(yù)后差,致死率高,嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康及生活質(zhì)量。目前已發(fā)現(xiàn)黑素瘤是多因素、多階段、多種分子事件共同作用導(dǎo)致的惡性疾病,其中異�；钚缘霓D(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)控下游靶基因而引起細(xì)胞下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變,繼發(fā)性影響細(xì)胞增殖與凋亡,侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,最終造成黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。然而現(xiàn)有的分子機(jī)制研究尚不足以十分明晰黑素瘤發(fā)生發(fā)展乃至侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)理。因此,探索黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療,對(duì)降低黑素瘤患者死亡率和改善黑素瘤患者預(yù)后具有顯著意義。SOX家族為一類調(diào)控組織特異性、器官發(fā)育、細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平激活或抑制下游基因及通路,參與并調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移行為。SOX4屬于SOX C亞家族成員,不僅在維持細(xì)胞干性,促進(jìn)骨及神經(jīng)組織正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用,還在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)且與腫瘤患者的預(yù)后及生存期相關(guān)。越來(lái)越多的研究顯示,SOX4可以通過(guò)影響細(xì)胞增殖,周期,凋亡等過(guò)程參與乳腺癌,肝癌,結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且有針對(duì)SOX4的T細(xì)胞及抗體表位肽研究應(yīng)用于肺癌的疫苗研制,靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達(dá)及調(diào)節(jié)其觸發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)可有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這強(qiáng)烈提示SOX4具有成為免疫疫苗靶點(diǎn)及治療腫瘤疾病靶點(diǎn)的巨大潛力。然而,SOX4與其調(diào)控的下游靶基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的詳盡作用及具體機(jī)制尚不明確。闡明SOX4在黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的具體作用,并探討挖掘其治療潛能,可為靶向治療黑素瘤及研制黑素瘤疫苗提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本課題擬通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤,原發(fā)黑素瘤,色素痣以及黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并從分子生物學(xué)水平研究轉(zhuǎn)錄因子SOX4對(duì)黑素瘤增殖,侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響,進(jìn)而闡明SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和具體機(jī)制,為黑素瘤臨床診療及預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。研究方法1.Real-time PCR法,western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SOX4在色素痣,原發(fā)黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)情況。2.Western blot方法檢測(cè)惡性黑素瘤細(xì)胞系中SOX4在蛋白水平的表達(dá)。3.使用轉(zhuǎn)染試劑將特異靶向SOX4的si RNA轉(zhuǎn)入黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058,WM35中,降低細(xì)胞內(nèi)源性SOX4的表達(dá)水平。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡水平以觀察轉(zhuǎn)錄因子SOX4對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。5.建立SOX4慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,real-time PCR及western blot方法檢測(cè)SOX4水平是否下調(diào),以此判斷細(xì)胞系是否建立成功。為下一步深入機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。6.在成功建立的SOX4低表達(dá)的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中,對(duì)EMT的標(biāo)志物E-cadherin進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果1.SOX4在黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)在RNA水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)水平顯著高于原發(fā)黑素瘤及色素痣,原發(fā)黑素瘤與色素痣中SOX4的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。色素痣中p53的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)移性黑素瘤和原發(fā)黑素瘤。Real-time PCR顯示相對(duì)瘤旁組織,瘤中心組織的SOX4水平明顯升高。Western blot法檢測(cè)顯示在蛋白水平上,原發(fā)黑素瘤及轉(zhuǎn)移性黑素瘤的SOX4表達(dá)水平高于色素痣組織,同時(shí)多個(gè)黑素瘤細(xì)胞系都檢測(cè)到了轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達(dá),且A2058及WM35細(xì)胞系中的表達(dá)量最為突出,于是選取此兩種細(xì)胞系作為下一步檢測(cè)生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2.SOX4對(duì)黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SOX4 si RNA后的黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058及WM35,相比對(duì)照組,SOX4表達(dá)水平降低,同時(shí)黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢,G l期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少,細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。3.成功構(gòu)建SOX4的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)A2058細(xì)胞系,在蛋白及m RNA水平上驗(yàn)證了SOX4的下調(diào)表達(dá)。4.成功建立慢病毒轉(zhuǎn)染A2058細(xì)胞系,western blot檢測(cè)顯示,當(dāng)SOX4水平降低時(shí),E-cadherin表達(dá)水平下降。研究結(jié)論:1.本研究通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在m RNA水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在黑素瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于原發(fā)黑素瘤組織和色素痣組織,但原發(fā)黑素瘤組織與色素痣組織之間無(wú)明顯差異。在蛋白水平上,轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織和原發(fā)性黑素瘤組織中的表達(dá)水平均明顯高于色素痣組織。得出結(jié)論,SOX4參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。2.通過(guò)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058及WM35瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SOX4 si RNA的實(shí)驗(yàn),在m RNA及蛋白水平上證實(shí)SOX4表達(dá)水平降低后,進(jìn)行細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:相比陰性對(duì)照組,SOX4 si RNA組的黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,G l期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少,細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子SOX4可以抑制黑素瘤細(xì)胞的凋亡,使G l期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加,加強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞的增殖能力。3.成功建立SOX4低表達(dá)的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系A(chǔ)2058,并檢測(cè)該細(xì)胞系EMT相關(guān)基因E-cadherin的表達(dá)情況。在蛋白水平上證明了轉(zhuǎn)錄因子SOX4與E-cadherin呈正相關(guān)性。說(shuō)明SOX4可能通過(guò)EMT相關(guān)蛋白分子促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：黑素瘤 轉(zhuǎn)錄因子 SOX4 EMT 侵襲轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-24
• 實(shí)驗(yàn)一 轉(zhuǎn)錄因子SOX4在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及意義24-36
• 1 材料24-29
• 2 方法29-32
• 3 結(jié)果32-34
• 4 討論34-36
• 實(shí)驗(yàn)二 轉(zhuǎn)錄因子SOX4對(duì)黑素瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響36-46
• 1 材料36-40
• 2 方法40-42
• 3 結(jié)果42-45
• 4 討論45-46
• 實(shí)驗(yàn)三 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立，鑒定及黑素瘤發(fā)病機(jī)制的初步探討46-52
• 1 材料46
• 2 方法46-48
• 3 結(jié)果48-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果58-59
• 致謝59

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本文編號(hào)：482675