目的: 惡性黑素瘤(簡稱黑素瘤),是來源于黑素細(xì)胞的惡性腫瘤。由于包括TRP2在內(nèi)的多種黑素瘤相關(guān)抗原的不斷發(fā)現(xiàn),以及部分黑素瘤患者中發(fā)現(xiàn)腫瘤自發(fā)消退現(xiàn)象表明機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠清除腫瘤細(xì)胞,該腫瘤已被作為腫瘤免疫治療的模式疾病。然而,TRP2等黑素瘤相關(guān)抗原的免疫原性低,腫瘤疫苗的療效甚微。本研究旨在構(gòu)建基于GM-CSF和MIP-1α的真核表達(dá)載體作為分子佐劑,建立基于TRP2的黑素瘤DNA疫苗,并在多種系統(tǒng)中進(jìn)行驗證,從而為進(jìn)一步探索黑素瘤等相關(guān)腫瘤的免疫治療打下基礎(chǔ)。 方法: 利用RT-PCR法從小鼠脾臟總RNA中分別擴(kuò)增小鼠GM-CSF和MIP-1α基因的cDNA,并將其與載體pVAX1連接,構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)載體。同時,以RT-PCR法從B16F10總RNA中擴(kuò)增小鼠TRP2基因的cDNA,并將其與載體pEGFP-N1連接,構(gòu)建其真核表達(dá)載體。所有載體經(jīng)測序驗證正確。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,ELISA方法鑒定GM-CSF的表達(dá),骨髓細(xì)胞集落形成法測定其生物活性;TRP2的表達(dá)以免疫印跡法鑒定,并以激光共聚焦顯微鏡觀察其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位;通過冰凍切片和...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
一、前言
    1 DNA疫苗
    2 分子佐劑
    3 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子
    4 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α
    5 黑素瘤腫瘤抗原酪氨酸相關(guān)蛋白2
    6 本課題的研究目的和意義
    7 本課題的技術(shù)路線
二、實(shí)驗材料與設(shè)備
    1 主要儀器和設(shè)備
    2 主要試劑和材料
    3 本實(shí)驗中所用主要試劑配制方法見附錄Ⅰ
三、實(shí)驗方法與步驟
    1 C57BL/6小鼠脾臟總RNA抽提及cDNA合成
    2 小鼠GM-CSF基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析
    3 小鼠GM-CSF重組質(zhì)粒的真核表達(dá)
    4 小鼠GM-CSF重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物活性測定
    5 小鼠GM-CSF和MIP-1α重組質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)分析
    6 小鼠MIP-1α基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析
    7 小鼠MIP-1α重組質(zhì)粒的真核表達(dá)
    8 C57BL/6小鼠黑素瘤總RNA抽提及cDNA合成
    9 小鼠TRP2基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析
    10 小鼠TRP2重組質(zhì)粒的真核表達(dá)
    11 小鼠TRP2重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
    12 小鼠TRP2重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位
    13 小鼠GM-CSF、MIP-1α和TRP2重組質(zhì)粒大規(guī)模制備
四、實(shí)驗結(jié)果
    1 小鼠GM-CSF全長基因cDNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列分析
    2 小鼠GM-CSF重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物的含量測定
    3 小鼠GM-CSF重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物活性分析
    4 小鼠GM-CSF重組質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)
    5 小鼠MIP-1α全長基因cDNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析
    6 小鼠MIP-1α重組質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)
    7 小鼠TRP2全長基因cDNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析
    8 小鼠TRP2全長基因cDNA真核表達(dá)產(chǎn)物的WESTERN BLOT鑒定
    9 小鼠TRP2重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位
五、討論
    1 分子佐劑GM-CSF和MIP-lα
    2 黑素瘤DNA疫苗
六、結(jié)論
REFERENCES(參考文獻(xiàn))
附錄Ⅰ 本實(shí)驗中所用主要試劑配制方法
附錄Ⅱ 英文縮略詞
附錄Ⅲ 在校期間發(fā)表及參與研究論文情況
致謝



本文編號：3907763