研究背景黑色素瘤是皮膚癌最具侵襲性的惡性腫瘤,占皮膚腫瘤死亡率的80%。目前,黑色素瘤治療的常用方法包括手術(shù)切除、化療和放療。然而,由于其耐藥性和轉(zhuǎn)移性,黑色素瘤患者的長期生存率并不理想,亟待尋求新的黑色素瘤治療靶點和治療策略。光動力療法（PDT）因其對腫瘤組織的高選擇性、對正常組織的毒副作用小及良好的美容效果,是目前繼傳統(tǒng)治療方法之后的一種新的皮膚腫瘤的治療手段。近年來,隨著對PDT作用機制更深入的研究,認(rèn)為PDT在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面效果顯著,并且能夠引發(fā)抗腫瘤免疫作用,可以預(yù)見,PDT將成為治療黑色素瘤的一種全新療法。盡管PDT抗腫瘤作用機制研究取得一定進展,但許多參與這一復(fù)雜過程的分子還未被發(fā)現(xiàn),確切的作用機制還沒有被完全闡明。因此,發(fā)現(xiàn)調(diào)控PDT抗腫瘤效應(yīng)的新分子對于加深人們對PDT作用機制的認(rèn)識和改進臨床療效具有重要的意義。蛋白4.1R最初是在人成熟紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的80KD細(xì)胞膜骨架蛋白分子,可以將跨膜蛋白與血影蛋白-肌動蛋白連接起來,對細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能發(fā)揮重要的作用。課題組前期研究,發(fā)現(xiàn)蛋白4.1R通過抑制CD8⁺T淋巴細(xì)... 

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常見英文縮略一覽表
第一章 引言
    1.1 黑色素瘤
    1.2 光動力療法
    1.3 5-ALA-PDT
    1.4 蛋白4.1R
    1.5 研究目的與意義
    1.6 技術(shù)路線
第二章 運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建敲除蛋白4.1R基因的B16細(xì)胞株
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 檢測蛋白4.1R在B16細(xì)胞中的表達
        2.2.3 sgRNA的設(shè)計及寡核苷酸鏈的合成
        2.2.4 重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA的構(gòu)建
        2.2.5 慢病毒的包裝
        2.2.6 慢病毒感染B16細(xì)胞
        2.2.7 有限稀釋法篩選單克隆
        2.2.8 免疫印跡法檢測細(xì)胞株內(nèi)4.1R蛋白表達
        2.2.9 細(xì)胞克隆鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 4.1R基因在B16細(xì)胞中的表達
        2.3.2 LentiCRISPRv2-sgRNA載體的構(gòu)建
        2.3.3 單克隆篩選結(jié)果
        2.3.4 免疫印跡法檢測單克隆細(xì)胞株內(nèi)4.1R表達
        2.3.5 測序驗證蛋白4.1R敲除效果
    2.4 討論
第三章 蛋白4.1R對B16細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 CCK-8 法檢測蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞增殖的影響
        3.2.3 劃痕實驗檢測蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞遷移能力的影響
        3.2.4 Transwell檢測蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞侵襲能力的影響
        3.2.5 統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白4.1R基因敲除促進B16細(xì)胞的增殖能力
        3.3.2 蛋白4.1R基因敲除促進B16細(xì)胞遷移能力
        3.3.3 蛋白4.1R基因敲除促進B16細(xì)胞侵襲能力
    3.4 討論
第四章 蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞PDT敏感性的影響
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 5-ALA最佳孵育濃度與時間確定
        4.2.3 蛋白4.1R敲除對B16細(xì)胞PDT敏感性的影響
        4.2.4 蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞內(nèi)PpIX積累量的影響
        4.2.5 蛋白4.1R基因敲除對PDT后B16細(xì)胞ROS含量的影響
        4.2.6 蛋白4.1R基因敲除對PDT后B16細(xì)胞凋亡的影響
        4.2.7 統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 5-ALA最佳孵育濃度與時間確定
        4.3.2 蛋白4.1R基因敲除降低B16細(xì)胞對PDT的敏感性
        4.3.3 蛋白4.1R基因敲除對B16細(xì)胞內(nèi)PpⅨ積累量的影響
        4.3.4 蛋白4.1R基因敲除對PDT后B16細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
        4.3.5 蛋白4.1R基因敲除對PDT后B16細(xì)胞凋亡的影響
    4.4 討論
第五章 蛋白4.1R影響B(tài)16細(xì)胞PDT敏感性的機制探索
    5.1 材料
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 qRT-PCR法檢測B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1、GAT-2mRNA的表達情況
        5.2.2 Westernblot法檢測GAT-1和GAT-2在B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)的表達情況
        5.2.3 免疫熒光法檢測GAT-1、GAT-2與蛋白4.1R定位情況
        5.2.4 免疫共沉淀法檢測GAT-1、GAT-2與蛋白4.1R的相互作用
        5.2.5 統(tǒng)計分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1、GAT-2基因表達情況
        5.3.2 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1和GAT-2蛋白表達情況
        5.3.3 GAT-1、GAT-2在B16細(xì)胞中與蛋白4.1R共定位
        5.3.4 GAT-1、GAT-2在B16細(xì)胞中與蛋白4.1R存在相互作用
    5.4 討論
第六章 蛋白4.1R對B16細(xì)胞體內(nèi)光動力效應(yīng)的影響
    6.1 材料
        6.1.1 實驗動物
        6.1.2 細(xì)胞株
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 主要儀器
        6.1.5 主要試劑配制
    6.2 實驗方法
        6.2.1 小鼠皮下移植瘤模型建立
        6.2.2 PDT處理方案
        6.2.3 腫瘤組織石蠟包埋、切片與H&E染色
        6.2.4 熒光定量PCR檢測腫瘤組織中細(xì)胞因子mRNA的表達
        6.2.5 ELISA法檢測細(xì)胞因子的表達
        6.2.6 腫瘤組織CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化
        6.2.7 統(tǒng)計分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 蛋白4.1R基因敲除下調(diào)PDT對腫瘤的殺傷效果
        6.3.2 熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中細(xì)胞因子mRNA的表達情況
        6.3.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子的表達
        6.3.4 腫瘤組織CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化結(jié)果
    6.4 討論
全文討論與總結(jié)
參考文獻
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進展[J]. 鄭小梅,張曉立,于建東,鄭平,孫際賓.  生物技術(shù)進展. 2015(01)
[2]食管小細(xì)胞癌組織中4.1蛋白家族的表達及意義[J]. 高艷鋒,祁元明,宋英,翟明霞,陳鯉翔.  山東醫(yī)藥. 2008(15)
[3]細(xì)胞骨架4．1蛋白基因家族在結(jié)直腸癌組織中的表達[J]. 馮文坡,陳鯉翔,寇曉丹,許晶晶,康巧珍,祁元明.  世界華人消化雜志. 2007(22)



本文編號：3701105