研究背景黑色素瘤是皮膚癌最具侵襲性的惡性腫瘤,占皮膚腫瘤死亡率的80%。目前,黑色素瘤治療的常用方法包括手術(shù)切除、化療和放療。然而,由于其耐藥性和轉(zhuǎn)移性,黑色素瘤患者的長(zhǎng)期生存率并不理想,亟待尋求新的黑色素瘤治療靶點(diǎn)和治療策略。光動(dòng)力療法（PDT）因其對(duì)腫瘤組織的高選擇性、對(duì)正常組織的毒副作用小及良好的美容效果,是目前繼傳統(tǒng)治療方法之后的一種新的皮膚腫瘤的治療手段。近年來(lái),隨著對(duì)PDT作用機(jī)制更深入的研究,認(rèn)為PDT在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面效果顯著,并且能夠引發(fā)抗腫瘤免疫作用,可以預(yù)見(jiàn),PDT將成為治療黑色素瘤的一種全新療法。盡管PDT抗腫瘤作用機(jī)制研究取得一定進(jìn)展,但許多參與這一復(fù)雜過(guò)程的分子還未被發(fā)現(xiàn),確切的作用機(jī)制還沒(méi)有被完全闡明。因此,發(fā)現(xiàn)調(diào)控PDT抗腫瘤效應(yīng)的新分子對(duì)于加深人們對(duì)PDT作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)和改進(jìn)臨床療效具有重要的意義。蛋白4.1R最初是在人成熟紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的80KD細(xì)胞膜骨架蛋白分子,可以將跨膜蛋白與血影蛋白-肌動(dòng)蛋白連接起來(lái),對(duì)細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能發(fā)揮重要的作用。課題組前期研究,發(fā)現(xiàn)蛋白4.1R通過(guò)抑制CD8⁺T淋巴細(xì)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常見(jiàn)英文縮略一覽表
第一章 引言
    1.1 黑色素瘤
    1.2 光動(dòng)力療法
    1.3 5-ALA-PDT
    1.4 蛋白4.1R
    1.5 研究目的與意義
    1.6 技術(shù)路線
第二章 運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建敲除蛋白4.1R基因的B16細(xì)胞株
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 檢測(cè)蛋白4.1R在B16細(xì)胞中的表達(dá)
        2.2.3 sgRNA的設(shè)計(jì)及寡核苷酸鏈的合成
        2.2.4 重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-sgRNA的構(gòu)建
        2.2.5 慢病毒的包裝
        2.2.6 慢病毒感染B16細(xì)胞
        2.2.7 有限稀釋法篩選單克隆
        2.2.8 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞株內(nèi)4.1R蛋白表達(dá)
        2.2.9 細(xì)胞克隆鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 4.1R基因在B16細(xì)胞中的表達(dá)
        2.3.2 LentiCRISPRv2-sgRNA載體的構(gòu)建
        2.3.3 單克隆篩選結(jié)果
        2.3.4 免疫印跡法檢測(cè)單克隆細(xì)胞株內(nèi)4.1R表達(dá)
        2.3.5 測(cè)序驗(yàn)證蛋白4.1R敲除效果
    2.4 討論
第三章 蛋白4.1R對(duì)B16細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 CCK-8 法檢測(cè)蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響
        3.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞遷移能力的影響
        3.2.4 Transwell檢測(cè)蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響
        3.2.5 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 蛋白4.1R基因敲除促進(jìn)B16細(xì)胞的增殖能力
        3.3.2 蛋白4.1R基因敲除促進(jìn)B16細(xì)胞遷移能力
        3.3.3 蛋白4.1R基因敲除促進(jìn)B16細(xì)胞侵襲能力
    3.4 討論
第四章 蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞PDT敏感性的影響
    4.1 材料
        4.1.1 細(xì)胞株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要試劑配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 5-ALA最佳孵育濃度與時(shí)間確定
        4.2.3 蛋白4.1R敲除對(duì)B16細(xì)胞PDT敏感性的影響
        4.2.4 蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)PpIX積累量的影響
        4.2.5 蛋白4.1R基因敲除對(duì)PDT后B16細(xì)胞ROS含量的影響
        4.2.6 蛋白4.1R基因敲除對(duì)PDT后B16細(xì)胞凋亡的影響
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 5-ALA最佳孵育濃度與時(shí)間確定
        4.3.2 蛋白4.1R基因敲除降低B16細(xì)胞對(duì)PDT的敏感性
        4.3.3 蛋白4.1R基因敲除對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)PpⅨ積累量的影響
        4.3.4 蛋白4.1R基因敲除對(duì)PDT后B16細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
        4.3.5 蛋白4.1R基因敲除對(duì)PDT后B16細(xì)胞凋亡的影響
    4.4 討論
第五章 蛋白4.1R影響B(tài)16細(xì)胞PDT敏感性的機(jī)制探索
    5.1 材料
        5.1.1 細(xì)胞株
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1、GAT-2mRNA的表達(dá)情況
        5.2.2 Westernblot法檢測(cè)GAT-1和GAT-2在B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況
        5.2.3 免疫熒光法檢測(cè)GAT-1、GAT-2與蛋白4.1R定位情況
        5.2.4 免疫共沉淀法檢測(cè)GAT-1、GAT-2與蛋白4.1R的相互作用
        5.2.5 統(tǒng)計(jì)分析
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1、GAT-2基因表達(dá)情況
        5.3.2 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)細(xì)胞內(nèi)GAT-1和GAT-2蛋白表達(dá)情況
        5.3.3 GAT-1、GAT-2在B16細(xì)胞中與蛋白4.1R共定位
        5.3.4 GAT-1、GAT-2在B16細(xì)胞中與蛋白4.1R存在相互作用
    5.4 討論
第六章 蛋白4.1R對(duì)B16細(xì)胞體內(nèi)光動(dòng)力效應(yīng)的影響
    6.1 材料
        6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        6.1.2 細(xì)胞株
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 主要儀器
        6.1.5 主要試劑配制
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 小鼠皮下移植瘤模型建立
        6.2.2 PDT處理方案
        6.2.3 腫瘤組織石蠟包埋、切片與H&E染色
        6.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)
        6.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)
        6.2.6 腫瘤組織CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化
        6.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 蛋白4.1R基因敲除下調(diào)PDT對(duì)腫瘤的殺傷效果
        6.3.2 熒光定量PCR法檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況
        6.3.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)
        6.3.4 腫瘤組織CD8+T淋巴細(xì)胞免疫組化結(jié)果
    6.4 討論
全文討論與總結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 鄭小梅,張曉立,于建東,鄭平,孫際賓.  生物技術(shù)進(jìn)展. 2015(01)
[2]食管小細(xì)胞癌組織中4.1蛋白家族的表達(dá)及意義[J]. 高艷鋒,祁元明,宋英,翟明霞,陳鯉翔.  山東醫(yī)藥. 2008(15)
[3]細(xì)胞骨架4．1蛋白基因家族在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)[J]. 馮文坡,陳鯉翔,寇曉丹,許晶晶,康巧珍,祁元明.  世界華人消化雜志. 2007(22)



本文編號(hào)：3701105