背景:在器官移植受者中,Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染可誘導(dǎo)致死性移植術(shù)后并發(fā)癥——移植后淋巴增殖性疾�。╬ost-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD）的發(fā)生,嚴(yán)重影響受者和移植物的預(yù)后。EBV是一種人類γ皰疹病毒,也是人們發(fā)現(xiàn)的首個(gè)致瘤病毒,其感染與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括B細(xì)胞淋巴瘤、NK/T細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等淋巴細(xì)胞或上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤。在免疫抑制如醫(yī)源性免疫抑制的情況下,EBV的致瘤風(fēng)險(xiǎn)大大上升。另一種常見的人類γ皰疹病毒卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）也是重要的致瘤病毒。γ皰疹病毒致瘤機(jī)制復(fù)雜,闡明病毒和宿主之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)和治療相關(guān)惡性腫瘤意義重大。EBV和KSHV由于其種屬特異性只能感染人類或部分靈長類動(dòng)物,不利于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的開展,且EBV和KSHV缺乏可進(jìn)行有效的體外裂解性復(fù)制的細(xì)胞系,極大地限制了病毒的研究工作。鼠γ皰疹病毒68（murine ga... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：129 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

KSHV、EBV、MHV-68、HVS四種γ皰疹病毒基因組及其功能比較

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文第一部分實(shí)驗(yàn)材料102.2實(shí)驗(yàn)材料2.2.1細(xì)胞和病毒2.2.1.1HEK293T細(xì)胞（人源胚胎腎細(xì)胞293T）和Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）均購自ATCC（AmericanTypeCulturecollection），在實(shí)驗(yàn)室凍存。細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM（Dulbecco"sModifiedEagleMedium）完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。2.2.1.2野生型MHV-68病毒購自ATCC，在實(shí)驗(yàn)室凍存。重組型MHV-68報(bào)告病毒MHV-68-M3FL由合作實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[65]。該報(bào)告病毒在tRNA-1和tRNA-2之間插入了一段由M3啟動(dòng)子調(diào)控的螢火蟲熒光素酶表達(dá)元件（圖2.1）。以上病毒均以0.01-0.05的感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）感染Vero細(xì)胞實(shí)現(xiàn)病毒擴(kuò)增。圖2.1重組型MHV-68報(bào)告病毒MHV-68-M3FL結(jié)構(gòu)示意圖。TR，terminalrepeat，末端重復(fù)序列；pM3，M3啟動(dòng)子序列；FL，螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因。2.2.2主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)液：購自美國Corning公司；

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文第一部分實(shí)驗(yàn)方法16病毒裂解性復(fù)制可導(dǎo)致重組型MHV-68報(bào)告病毒MHV-68-M3FL的螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了熒光素酶活性結(jié)果和空斑實(shí)驗(yàn)法測得的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)這兩者線性相關(guān)（圖2.2），熒光素酶活性可有效代表病毒滴度。因此，我們無需通過病毒空斑實(shí)驗(yàn)逐個(gè)檢測每孔病毒的滴度，只需要批量檢測各孔熒光素酶活性即可知道病毒裂解性復(fù)制水平，這為高通量篩選提供了機(jī)會(huì)。圖2.2熒光素酶活性與病毒滴度的相關(guān)性。（1）60ngcDNA表達(dá)質(zhì)粒利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入384孔板中的HEK293T細(xì)胞中。（2）24小時(shí)后，重組型MHV-68-M3FL病毒感染HEK293T細(xì)胞（MOI=0.01）。（3）為盡可能消除cDNA表達(dá)產(chǎn)物對(duì)M3啟動(dòng)子的直接影響，在病毒感染50小時(shí)后取10μl上清感染新的384孔板中的正常HEK293T細(xì)胞。（4）18小時(shí)后，檢測新感染的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)孔的熒光素酶活性。在384孔板中加入30μlBright-GloLuciferaseAssayReagent，2分鐘后檢測熒光素酶活性。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Regulation of Wnt/β-catenin signaling by herpesviruses[J]. Kevin J Zwezdaryk,Joseph A Combs,Cindy A Morris,Deborah E Sullivan.  World Journal of Virology. 2016(04)
[2]Recent insights in the pathogenesis of post-transplantation lymphoproliferative disorders[J]. Julie Morscio,Thomas Tousseyn.  World Journal of Transplantation. 2016(03)



本文編號(hào)：3608572