發(fā)布時(shí)間：2021-11-24 04:11

　　目的鑒定一家系長島型掌跖角化癥（NPPK）的突變位點(diǎn),闡明NPPK的發(fā)病機(jī)制。方法將收集的2例NPPK病人外周血,提取DNA后對GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1五個(gè)基因進(jìn)行測序,鑒定突變位點(diǎn);連接蛋白轉(zhuǎn)錄物顯微注射卵母細(xì)胞,分別為:縫隙連接蛋白（Connexin,Cx）)26、Cx31、Cx26+Cx31、Cx26+Cx26-S183F、Cx31+Cx26-S183F及注射水的對照組,并通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄半通道電流;蛋白質(zhì)印跡檢測法檢測NPPK突變體及野生型Cx31的表達(dá)水平;通過免疫共沉淀檢測Cx26 NPPK突變體與Cx31的互作情況。結(jié)果測序發(fā)現(xiàn)Cx26（GJB2）基因發(fā)生了突變（c.548C>T）,第183位的絲氨酸被苯丙氨酸取代（p.Ser183Phe）導(dǎo)致了NPPK;當(dāng)在卵母細(xì)胞單獨(dú)表達(dá)Cx26-S183F時(shí),不能形成間隙連接通道或半通道;突變體與野生型Cx31的共表達(dá),顯示Cx31間隙連接通道的反式顯性抑制,而不降低Cx31蛋白質(zhì)合成;免疫共沉淀表明,與野生型相比,突變體Cx26對Cx31蛋白更有效地下拉,說明增強(qiáng)了異型連接子的形成;在Cx26突變體... 

【文章來源】：安徽醫(yī)藥. 2020,24(01)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

檢測各處理組（注入水、Cx26、Cx26-S183F、Cx26-S183F+Cx26）卵母細(xì)胞的間隙連接的電導(dǎo)率：A為檢測野生型Cx26、Cx26突變體及Cx26-S183F+Cx26的電導(dǎo)率，B為檢測野生型Cx31、Cx31+Cx26及Cx31+Cx26-S183F的電導(dǎo)率

用蛋白質(zhì)印跡法檢測野生型和突變體連接蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，注射Cx31、Cx31+Cx26、Cx31+Cx26-S183F的處理組中均檢測到Cx31蛋白（31kDa）（圖2A），灰度值分析表明各處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2B）。同理，在Cx26、Cx31+Cx26、Cx26-S183F、Cx26+Cx26-S183F及Cx31+Cx26-S183F處理組中均檢測到Cx26(26kDa）（圖2C），且表達(dá)量一致，定量分析顯示各處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2D）。說明Cx26-S183F突變體存在時(shí)功能活性的喪失與Cx31的翻譯效率無關(guān)。2.4 Cx26突變體與Cx31的互相作用

KID綜合征突變體單獨(dú)存在時(shí)通常形成活躍的半通道[14-16]，而NPPK突變是否會(huì)出現(xiàn)類似的情況，為證實(shí)這一結(jié)果，在單個(gè)卵母細(xì)胞中表達(dá)Cx26和Cx26-S183F來分析半通道活性。結(jié)果顯示，注射水的卵母細(xì)胞對照在所有電壓階段被限流（圖4A),Cx26半通道活性在去極化時(shí)出現(xiàn)外向電流（圖4B），與注射Cx26的細(xì)胞相比，Cx26-S183F的膜電流顯著地降低（圖4C）。以平均膜電流和膜電壓作圖，表達(dá)CX26的細(xì)胞出現(xiàn)較高的外向電流，并隨著去極化的增加而增加，在+60mV時(shí)，Cx26產(chǎn)生的電流顯著高于對照及Cx26-S183F突變體（P<0.05，圖4D）。結(jié)果說明，注射突變體的細(xì)胞天然半通道活性喪失，Cx26-S183F與野生型Cx26的共表達(dá)導(dǎo)致半通道活性降低。圖4 膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測長島型掌跖角化癥（NPPK）野生型Cx26和突變體的膜電流：A為檢測注射水的對照組卵母細(xì)胞的電流，B為檢測單獨(dú)注射Cx26的卵母細(xì)胞的電流，C為檢測單獨(dú)注射Cx26突變體的卵母細(xì)胞的電流，D為半通道I-V曲線圖


本文編號：3515210