目的探討O⁶-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因沉默對人黑色素瘤細胞替莫唑胺（TMZ）敏感性的影響。方法將前期構(gòu)建的靶向MGMT基因特異性短發(fā)夾型RNA（shRNA）干擾載體轉(zhuǎn)染人黑色素瘤A375細胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同及是否加藥分組如下:對照組、TMZ組、陰性對照（NC）組、NC-TMZ組、MGMT干擾（MGMTi）組和MGMTi-TMZ（MGMT干擾聯(lián)合TMZ）組。通過實時熒光定量PCR（qPCR）、Western blotting和免疫熒光驗證質(zhì)粒載體的干擾效率,MTT法和流式細胞術(shù)檢測TMZ處理24、48和72 h后A375細胞的增殖和凋亡情況。Western blotting和免疫熒光檢測ATR、ATM和γ-H2AX水平以評價細胞DNA的損傷程度。結(jié)果轉(zhuǎn)染MGMT shRNA干擾載體后,MGMTi組MGMT在mRNA和蛋白水平與對照組相比降低（P<005）。MTT、流式細胞儀、Western blotting和免疫熒光檢測結(jié)果顯示,MGMTi-TMZ組的細胞抑制率、凋亡率及ATR、ATM和γ-H2AX水平較其他組明顯升高（P<005... 

【文章來源】：臨床腫瘤學雜志. 2020,25(12)北大核心

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【部分圖文】：

各組A375細胞的增殖抑制曲線

圖4 各組A375細胞凋亡檢測的流式細胞記錄圖綜上所述，沉默MGMT基因的表達能夠增強TMZ對A375細胞增殖的抑制作用并促進細胞凋亡，同時增強DNA損傷作用。通過沉默MGMT基因可以提高人黑色素瘤A375細胞對TMZ的敏感性。

圖2 各組A375細胞的增殖抑制曲線MGMT主要通過“自殺式”作用將DNA上的烷基或甲基予以置換而修復DNA，置換后MGMT分子即失去活性，因此細胞內(nèi)MGMT的活性直接與MGMT的表達水平呈正相關(guān)[18-19]。細胞內(nèi)MGMT的高表達水平可以反映DNA修復水平及相應的化療藥物耐藥能力。本研究首先使用前期構(gòu)建成功的shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染A375細胞，在體外水平干擾MGMT基因的表達。Western blotting和qPCR結(jié)果表明MGMTi組的MGMT在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上低于對照組。既往文獻報道，在缺乏MGMT表達時，TMZ誘導的O6-甲基鳥嘌呤損傷不能被及時修復，累積在基因組中[13]。本研究結(jié)果提示細胞內(nèi)MGMT基因沉默后，TMZ對黑色素瘤的殺傷作用顯著增強，如MGMTi-TMZ組與NC-TMZ組相比抑制率升高，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示MGMTi-TMZ組的細胞凋亡率顯著上升，提示沉默MGMT后可以增強TMZ對人黑色素瘤A375細胞的殺傷作用。DNA損傷是烷化劑殺傷細胞的重要形式，DNA損傷發(fā)生后，細胞內(nèi)可出現(xiàn)一系列的損傷相關(guān)蛋白改變，包括ATM和ATR的磷酸化及γH2AX在核內(nèi)表達增多等，這一系列變化可直接或間接反映細胞內(nèi)DNA損傷水平[20]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，干擾MGMT基因表達后，TMZ導致的DNA損傷程度也顯著增強，進一步證實了沉默黑色素瘤細胞中的MGMT基因可增強其對TMZ的敏感性。本研究構(gòu)建的干擾載體證實抑制MGMT的表達可增強TMZ對黑色素瘤細胞的抗腫瘤效果，為后續(xù)體內(nèi)實驗提供重要理論依據(jù)和實驗基礎。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]靶向人MGMT的shRNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定[J]. 胡穎熹,馮城婷,陶敏,梁容瑞,趙晶,李瑋,史悅,石鳳靈,李大鵬.  現(xiàn)代儀器與醫(yī)療. 2018(06)



本文編號：3458217