本文關(guān)鍵詞：MAD2B與TCF4的相互作用及其對毛乳頭細胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一．研究背景和目的 毛囊是皮膚的附屬器官，是毛發(fā)生長的主體，作為人體唯一可以完全循環(huán)再生的器官，毛囊的研究具有重要的生物學意義；而且毛囊相關(guān)的疾病直接影響患者的外部形象，使患者承受了很大的心理壓力，影響身心健康。因此毛囊的研究日益受到重視。 毛乳頭(dermal papilla，DP)位于毛囊的基底部，在毛囊的形態(tài)發(fā)育以及周期性再生調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，，而且在體外培養(yǎng)中可以誘導毛囊的重建。毛乳頭細胞(dermalpapilla cells，DPC)是構(gòu)成DP的唯一細胞，不僅在胚胎期誘導上皮細胞形成毛囊，而且在出生后調(diào)控成熟毛囊的周期性再生。這種調(diào)控可通過自分泌、旁分泌等方式作用于DPC自身和周邊細胞，機制涉及多種信號通路和調(diào)節(jié)因子，比較重要的有Wnt蛋白、Notch蛋白、骨形成蛋白(BMP)、纖維生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(KGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)等多種蛋白及細胞因子。因此，DPC是目前毛囊相關(guān)研究的熱點細胞之一。DPC的重要生物學特征是凝集性生長，這種特性和DP的功能狀態(tài)相關(guān)，其凝集性生長和體外誘導毛囊重建的機制尚不清楚，各種信號通路對DPC的調(diào)節(jié)作用仍需要進一步研究。 現(xiàn)研究證實，Wnt通路在毛發(fā)發(fā)育和周期調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，對維持DPC的凝集生長能力有著關(guān)鍵的作用。我科前期實驗證實，Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子T細胞生長因子4(T cell factor，TCF4)在凝集生長的DPC特異表達，增強TCF4的表達對體外培養(yǎng)的DPC有明顯促進作用，并可以促進DPC中SCF、HGF等外分泌因子的表達，通過自分泌和旁分泌機制調(diào)控毛囊的發(fā)育。MAD2B(mitotic arrest deficient2-like2，又稱MAD2L2)蛋白是通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)的可與TCF4結(jié)合的蛋白，在有絲分裂的周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。本課題擬研究在凝集狀態(tài)下生長的DPC中是否存在MAD2B蛋白和TCF4的相互作用，以及其是否對TCF4調(diào)控的Wnt信號通路活性和下游細胞因子的表達存在調(diào)控作用，是否影響DPC的生物學功能。 二、實驗方法和結(jié)果 1、從人頭皮毛囊中分離培養(yǎng)DPC，觀察原代及其傳代的DPC生長特性，提取其總的RNA，以供后續(xù)試驗。 2、利用免疫共沉淀技術(shù)測定在DPC中MAD2B蛋白和TCF4蛋白存在相互作用。 3、構(gòu)建pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至DPC，使用倒置熒光顯微鏡、Western blot明確其在DPC內(nèi)存在過表達，質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染成功。 4、設(shè)置試驗分組：pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組，正常DPC對照組。結(jié)果證實，與單獨轉(zhuǎn)染pIRES2-TCF4組相比，共轉(zhuǎn)染pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4后Wnt/β-catenin信號有明顯的降低(p＜0.05)，而siMAD2B和pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染后則能糾正這種降低。pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組和siMAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組的Wnt/β-catenin信號都比對照組有明顯的升高(p＜0.05)。使用CCK-8測定對細胞增殖活性的影響，pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組的D450平均值為0.49±0.18，pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組D450平均值為0.79±0.15，正常DP對照組D450平均值為0.57±0.15。其中pIRES2-TCF4轉(zhuǎn)染組與pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組和正常DP對照組有明顯差異(p＜0.05)；pIRES2-MAD2B、pIRES2-TCF4共轉(zhuǎn)染組與正常DP組未見明顯差異。 5、通過熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在MAD2B過表達的DPC，其分泌的細胞因子IGF-1、VEGF和HGF的mRNA的表達，相對于正常對照組有明顯減少。 三、結(jié)論 1、免疫共沉淀進一步證實MAD2B與TCF4在DPC中存在相互作用。 2、MAD2B過表達可能通過Wnt信號通路途徑抑制DPC的增殖。 3、過表達MAD2B可抑制DPC旁分泌因子IGF-1、VEGF、HGF的合成。 通過以上實驗，為進一步了解DPC生物學功能，特別是Wnt途徑在DPC中的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：毛乳頭細胞 T細胞因子4 MAD2B Wnt 細胞因子
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R758.71
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-16
• 第二章 毛乳頭細胞的分離、傳代及培養(yǎng)16-24
• 2.1 試驗材料16-17
• 2.2 實驗方法17-20
• 2.3 實驗結(jié)果20-22
• 2.4 討論22-24
• 第三章 MAD2B 與 TCF4 過表達質(zhì)粒的構(gòu)建及胞內(nèi)相互作用的檢測24-42
• 3.1 實驗材料24-27
• 3.2 實驗方法27-37
• 3.3 實驗結(jié)果37-41
• 3.4 討論41-42
• 第四章 MAD2B 對毛乳頭細胞中 Wnt 信號通路作用及生物學功能分析42-50
• 4.1 實驗材料42
• 4.2 實驗方法42-45
• 4.3 實驗結(jié)果45-48
• 4.4 討論48-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻51-55
• 文獻綜述 毛乳頭細胞與 Wnt 信號通路55-64
• 參考文獻60-64
• 碩士期間發(fā)表的文章64-65
• 致謝65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 夏汝山;郝飛;牟芝蓉;楊希川;宋志強;鐘白玉;;凝集性生長毛乳頭細胞蛋白質(zhì)組的差異分析[J];中國皮膚性病學雜志;2008年05期

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  本文關(guān)鍵詞：MAD2B與TCF4的相互作用及其對毛乳頭細胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：345164