第一部分pAdenoG-CMV-IL-7-SV40-CCL21腺病毒載體的構(gòu)建目的建立IL-7、CCL21雙基因表達腺病毒載體,使之能在鼠源黑色素瘤B16F10細胞中過表達,為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。方法GenBank中查找目的基因序列,設(shè)計引物,PCR擴增目的基因片段,酶切載體后重組構(gòu)建IL-7-CCL21-pDONR,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后進行重組菌的篩選,選擇陽性克隆,擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,驗證正確后進行包裝、收獲、純化、測定病毒滴度,轉(zhuǎn)染B16F10細胞,采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定目的基因表達情況。結(jié)果雙酶切及測序結(jié)果證明目的基因正確插入載體中。轉(zhuǎn)染HEK293細胞觀察細胞狀態(tài),正常出毒。轉(zhuǎn)染B16F10細胞后,與野生型細胞株相比較,基因在mRNA水平及蛋白水平均有過表達,且差異有顯著性意義（P<0.05）。腺病毒包裝成功,滴度測定為2.2×10¹¹ pfu/ml。結(jié)論Ad-IL-7-CCL21雙基因腺病毒共表達載體構(gòu)建成功,可在B16F10細胞中成功轉(zhuǎn)染... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析

陽性克隆測序圖

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3314326