目的:構(gòu)建抗黑色素瘤免疫細(xì)胞因子ScFv-mTNF-α,在大腸桿菌中表達(dá)并純化具有黑色素瘤特異性結(jié)合活性和殺傷活性的融合蛋白,為黑色素瘤的抗體導(dǎo)向治療打下基礎(chǔ)。方法:為了避免使用天然型TNF-α所造成的強烈的副作用,我們嘗試用高生物學(xué)活性、低毒性的突變型TNF-α（mTNF-α）將天然型TNF-α替代,與抗黑色素瘤單鏈抗體構(gòu)建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫細(xì)胞因子原核表達(dá)載體pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鑒定正確后,通過在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)、純化,用制備的融合蛋白在體外對L929細(xì)胞進(jìn)行TNF活性的檢測,對B16-F10黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷實驗,在體內(nèi)對荷黑色素瘤Balb/c小鼠進(jìn)行導(dǎo)向治療研究,以期獲得具有臨床應(yīng)用潛能的抗黑色素瘤免疫細(xì)胞因子。首先鑒定本室保存的兩個質(zhì)粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并對其進(jìn)行測序,用獲得的測序結(jié)果推導(dǎo)出對應(yīng)的氨基酸序列,查閱文獻(xiàn)獲得linker序列,將模擬得到的理論融合蛋白片斷通過Insight II軟件,采用同源建模、分子力學(xué)和分子動力學(xué)等方法預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶和linke... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ScFv酶切鑒定結(jié)果

- 25 -處可見明顯條帶，與預(yù)期的pGEX-4T-1質(zhì)粒和mTNF-α片斷一致（圖1.2和圖1.3）。M 1 2 1 2 M M圖1.2、ScFv酶切鑒定結(jié)果 圖1.3、mTNF-α酶切鑒定結(jié)果1-2：pGEX-4T-1/ScFv質(zhì)粒 1-2：pGEX-4T-1/mTNF-α質(zhì)粒M：Marker M：Marker（2）ScFv基因片斷和mTNF-α基因片段測序結(jié)果①ScFv基因測序結(jié)果：1 ATGCAGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGCA GAGCTTGTGA AGCCAGGGGC CTCAGTCAAG61 TTGTCCTGCA CAGCTTCTGG CTTCAACATT AAAGACACCT ATATGCACTG GGTGAAGCAG

圖1.4、scFv部分測序圖譜因測序結(jié)果：AC GTAAGCCTGT AGCCCATGTT GTAGCAAACC CTCAAGCTGA GGGGCAGCGA ACCGCCGGGC CAATGCCCTC CTGGCCAATG GCGTGGAGCT GAGAGATAGG TGCCATCAGA GGGCCTGTAC CTCATCTACT CCCAGGTCCT CTTCAAGGGCC CCTCCACCCA TGTGCTCCTC ACCCACACCA TCAGCCGCAT CGCCGTCTCCA AGGTCAACCT CCTCTCTGCC ATCAAGAGCC CCTGCCAGAG GGAGACCCCTG AGGCCAAGCC CTGGTATGAG CCCATCTATC TGGGAGGGGT CTTCCAGCGTG ACCGACTCAG CGCTGAGATC AATCGGCCCG ACTATCTCGA CTTTGCCGAGG TCTACTTTGG GATCATTGCC TTCTGA

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]3種新型人腫瘤壞死因子衍生物在大腸桿菌中的表達(dá)與活性檢測[J]. 徐春曉,倪道明,張振龍,王春榮,趙秀芬.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 2000(02)
[2]單鏈抗體基因在大腸桿菌高效表達(dá)研究進(jìn)展[J]. 劉玉英.  國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊). 1997(06)
[3]外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究進(jìn)展[J]. 龍建銀,王會信.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 1997(02)
[4]單鏈抗體的研究及應(yīng)用[J]. 白玉杰.  國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊). 1997(02)
[5]一種高活性人新型TNF的研制[J]. 劉麗,田生禮,馮彪,王國志,謝寶樹,冷愛軍.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 1996(04)
[6]肝癌單抗重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列測定[J]. 胡川閩,劉彥仿,高磊,陳蘇民,陳南春,高輝,金衛(wèi)林.  免疫學(xué)雜志. 1996(03)
[7]抗人肝癌單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因的體外擴增、克隆及序列測定[J]. 楊萍,劉彥仿,胡川閩,陳志南,隋延仿,陳蘇民,高磊,陳南春,楊安鋼.  中華腫瘤雜志. 1994(04)
[8]一種新型人TNF表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌中的高表達(dá)[J]. 何曉龍,常金麗,蔡武城,喻紅,呂群,趙壽元,王成海,林葆城,朱鶴年.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 1994(03)

博士論文
[1]分泌型單鏈雙功能抗體基因修飾的T淋巴細(xì)胞抗肝癌活性的實驗研究[D]. 程虹.第四軍醫(yī)大學(xué) 1999



本文編號：3275078