背景:白癜風是以局限性脫色斑、功能性黑素細胞減少或消失為特征的獲得性皮膚病,是一種多發(fā)性、難治性疾病,發(fā)病率逐年上升。白癜風的發(fā)病機制尚未被清楚地闡明,現(xiàn)有的研究結(jié)果涉及多個學說。近年來越來越多的研究認為,白癜風是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用,造成黑素細胞受到損傷的結(jié)果。在特定的個體遺傳背景下,氧化應激可能是白癜風皮損最早期的事件,它啟動黑素細胞的破壞或凋亡,誘導針對自身抗原的特異性免疫應答。很多研究表明,白癜風患者的表皮有H2O2的蓄積,從而引起黑素細胞的氧化損傷�？赏ㄟ^H2O2建立誘導黑素細胞的氧化應激損傷體外模型,對白癜風復雜的發(fā)病機制進一步研究。遺傳學研究顯示,個體罹患疾病的易感性由基因遺傳變異決定。一些位于基因編碼區(qū)的SNP或突變可影響基因的表達和功能,與白癜風的發(fā)病相關。在分子流行病學研究檢測出的易感候選基因中,中國家族性白癜風患者攜帶血小板源性生長因子受體α(PDGFRα)編碼基因位點突變率顯著高于正常人群,支持該基因在部分白癜風患者發(fā)病中可能具有作用。同時研究顯示氧化應激可誘導PDGFRα酪氨酸磷酸化,PDGFRα促進氧化應激損傷中一些種類的細胞的生存。那么在H2O2誘導黑素細胞氧化應激損傷中,PDGFRα及其下游信號通路是否在黑素細胞生存中發(fā)揮作用,成為本課題研究的主要內(nèi)容。目的:本課題通過調(diào)節(jié)PDGFRα基因PDGFRA的表達,研究該基因?qū)θ撕谒丶毎淖允�、凋亡現(xiàn)象及一些重要功能蛋白的影響和作用機制,以闡述PDGFRα在H2O2誘導的氧化應激損傷中與黑素細胞生存相關的生物學功能。方法:1.采用RT-PCR和Western-blot的方法,分別檢測人原代黑素細胞、正常人表皮永生化黑素細胞系PIG1、白癜風患者表皮永生化黑素細胞系PIG3V中PDGFRA的m RNA和蛋白的表達情況。2.分別在正常人黑素細胞系PIG1、白癜風患者黑素細胞系PIG3V中,采用CCK-8的方法檢測細胞活性并確定最適H2O2處理終濃度。分別在不同時間和使用不同濃度H2O2處理黑素細胞PIG1,采用Western-blot的方法檢測PDGFRα的表達變化。3.分別轉(zhuǎn)染黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V PDGFRA-si RNA、人PDGFRA過表達質(zhì)粒,采用q RT-PCR、Western-blot的方法,檢測兩種黑素細胞系中PDGFRA的m RNA和蛋白的表達情況。4.分別下調(diào)和上調(diào)黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V的PDGFRA并經(jīng)H2O2處理24h后,采用流式細胞術(shù)的方法檢測兩種黑素細胞的凋亡情況。5.分別下調(diào)和上調(diào)黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V的PDGFRA并經(jīng)H2O2處理24h后,采用Western-blot的方法檢測兩種黑素細胞的自噬相關蛋白、抗凋亡相關蛋白及黑素小體相關蛋白的表達情況。6.確定PDGFRα特異性配體PDGF-AA的最適處理濃度后,使用PDGF-AA或/和H2O2處理黑素細胞PIG1 24h,采用Western-blot的方法檢測黑素細胞PIG1中PDGFRα、主要自噬蛋白、黑素細胞功能核心調(diào)節(jié)分子,以及PI3K/AKT/m TOR通路分子的表達情況。7.轉(zhuǎn)染表達人LC3的熒光蛋白質(zhì)粒后,分別用PDGF-AA和H2O2處理兩種黑素細胞24h,在熒光顯微鏡下觀察黑素細胞胞質(zhì)中自噬體的形成情況。之后采用CCK-8的方法檢測黑素細胞PIG1活性以確定該通路抑制劑最適處理濃度并處理,采用Western-blot的方法檢測PDGFRα及下游相關通路分子的表達情況。結(jié)果:1.在體外培養(yǎng)的人原代黑素細胞、正常人黑素細胞系PIG1、白癜風患者黑素細胞系PIG3V中均檢測出PDGFRα基因m RNA和蛋白的表達。2.在兩種黑素細胞中建立的氧化應激損傷模型中,確定了正常人黑素細胞系PIG1和白癜風患者黑素細胞系的H2O2處理最適終濃度。在黑素細胞PIG1中分別給予不同濃度的H2O2處理,檢測到PDGFRα的表達與H2O2呈正相關。在不同時間點給予H2O2處理黑素細胞PIG1,檢測到PDGFRα的表達在30 min內(nèi)明顯增加。3.在黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V中,篩選出干涉PDGFRα基因m RNA和蛋白表達的最適si RNA。將PDGFRα基因過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染這兩種黑素細胞,檢測到該基因m RNA和蛋白表達顯著增加。4.在黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V中分別上調(diào)和下調(diào)PDGFRα基因并誘導氧化應激,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:兩種黑素細胞中,與對照組相比,轉(zhuǎn)染PDGFRA-si RNA的黑素細胞凋亡率明顯增加(P0.01),轉(zhuǎn)染PDGFRα基因過表達質(zhì)粒的黑素細胞凋亡率明顯減少(P0.05)。Western-blot檢測結(jié)果顯示:兩種黑素細胞中,與對照組相比,轉(zhuǎn)染PDGFRA-si RNA后LC3II/I、Beclin-1表達明顯增加,Bcl-2表達明顯減少,轉(zhuǎn)染PDGFRα基因過表達質(zhì)粒后LC3II/I、Beclin-1表達明顯減少,Bcl-2表達明顯增加。5.Western-blot檢測結(jié)果顯示:正常人黑素細胞PIG1中,與對照組相比,PDGFRA-si RNA的下調(diào)組MITF、gp100、TYR、TRP-1表達明顯減少,PDGFRα基因過表達質(zhì)粒的上調(diào)組MITF、gp100、TYR、TRP-1表達明顯增加;白癜風患者黑素細胞PIG3V中,與對照組相比,PDGFRA-si RNA的下調(diào)組MITF、gp100、TYR、TRP-1表達明顯減少,PDGFRα基因過表達質(zhì)粒的上調(diào)組MITF、gp100表達明顯增加,TYR、TRP-1表達未見明顯變化。6.不同濃度PDGF-AA處理黑素細胞PIG1后,檢測到p-PDGFRα,p-AKT,p-m TOR蛋白表達隨PDGF-AA濃度增加而增加。PDGF-AA和H2O2共處理黑素細胞PIG1,檢測到與對照組相比,p-AKT、p-m TOR、MITF表達明顯增加,LC3II/I、Beclin-1表達明顯減少。7.轉(zhuǎn)染黑素細胞PIG1、黑素細胞PIG3V LC3過表達質(zhì)粒,經(jīng)PDGF-AA預處理、H2O2誘導氧化應激后,在熒光顯微鏡下觀察到LC3紅色熒光蛋白定位的自噬體數(shù)較無PDGF-AA處理組明顯減少。8.確定黑素細胞PIG1信號通路分子PI3K、AKT、m TOR抑制劑的最適處理濃度,給予H2O2和/或PDGF-AA處理。同時用PI3K抑制劑LY294002、AKT抑制劑MK2206處理后,檢測到p-AKT、p-m TOR表達明顯減少;用m TOR抑制劑Rapamycin處理后,檢測到p-m TOR表達明顯減少。三種抑制劑處理后,LC3II/I、Beclin-1表達均明顯增加。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)的人原代黑素細胞、正常人表皮永生化黑素細胞系PIG1、白癜風患者表皮永生化黑素細胞系PIG3V都表達PDGFRα,PDGFRα隨H2O2濃度增加表達明顯增加。2.在人黑素細胞PIG1、PIG3V中,下調(diào)PDGFRα基因的表達,自噬相關蛋白表達明顯增加,抗凋亡相關蛋白表達明顯減少,黑素小體相關蛋白表達明顯減少;自噬和凋亡水平都明顯增高,不利于H2O2誘導的氧化應激下黑素細胞的生存。相反,上調(diào)PDGFRα基因的表達,自噬相關蛋白表達明顯減少,抗凋亡相關蛋白表達明顯增加,黑素小體相關蛋白表達明顯增加;自噬和凋亡水平都明顯降低,有利于氧化應激下黑素細胞的生存。3.在H2O2誘導的氧化應激下,PDGF-AA/PDGFRα減少了黑素細胞PIG1自噬體的形成,可通過PI3K/AKT/m TOR信號通路抑制LC3II/I和Beclin-1的表達,減少了黑素細胞的自噬性死亡。因此PDGF-AA/PDGFRα在氧化應激中可通過PI3K/AKT/m TOR信號通路對人黑素細胞的生存起到保護作用。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R758.41
【部分圖文】：

Gallini R, Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicienes & development 2008;22(10):1276-1312.圖1 PDGFRα及下游主要信號通路示意圖4 PDGF/PDGFR 相關疾病的治療在PDGF信號發(fā)揮作用的腫瘤性疾病中，治療上使用一些抑制劑相對安全，抑DGFR的不同策略包括阻斷性抗體、針對配體和激酶的抑制劑[92]。臨床試驗提示馬替尼等藥物，阻斷PDGFR激酶活性，可有效治療多種PDGFR活化的人類癌癥[9的信號分子抑制劑也正在應用中，如小分子靶向PI3K，AKT，mTOR等聯(lián)合治以提高療效，還有一些研究闡述PDGF在腫瘤基質(zhì)、血管生成、人纖維性疾病、等中的作用[93]。

1 pCMV6-Entry-PDGFRΑ 過表達質(zhì)粒的和培養(yǎng)的分離和培養(yǎng)碘伏，浸泡包皮環(huán)切術(shù)后的新鮮成人包皮DMEM/F12培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)皿中，用無組織、血管等，之后用PBS清洗2遍，將表皮濾器將Dispase分散酶溶液加入有皮片的清洗2遍后，輕輕將真皮與表皮剝離，表溫消化約20 min后，用含10%胎牛血清的

0.4 mM，0.5 mM，0.6 mM，0.7 mM終濃度的H2O2共孵育，培養(yǎng)于基，作用時間為24 h，之后用CCK-8的方法檢測黑素細胞的活性變化。黑素細胞PIG1活性隨H2O2濃度增加而降低，當H2O2處理終濃度為0.4 胞PIG1的活性開始出現(xiàn)明顯降低，降至（77.94±5.21）%， P<0.05，義；當H2O2處理終濃度為0.5 mM時，細胞活性顯著降低，降至（66.31±，具有統(tǒng)計學意義。如圖1-5所示，黑素細胞PIG3V活性也隨H2O2濃度當H2O2處理終濃度為0.3 mM時，黑素細胞PIG3V的活性開始出現(xiàn)顯著59.28±6.02）%，P<0.01，具有統(tǒng)計學意義。選擇0.5 mM終濃度的H胞PIG1和0.3 mM終濃度的H2O2處理黑素細胞PIG3V，既可誘導黑素細效應使活性受明顯抑制，又不會導致細胞死亡過多，因此作為后續(xù)實素細胞誘導氧化應激的處理濃度。同時結(jié)果也提示，白癜風患者黑與正常人黑素細胞PIGI的反應性相比，黑素細胞PIG3V對H2O2誘導的氧。

本文編號：2843220