目的:本試驗(yàn)旨在探索一種能夠明顯縮短角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞接種密度和適合組織工程應(yīng)用的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基。通過檢測(cè)各代角質(zhì)形成細(xì)胞中朗格漢斯細(xì)胞(langerhans cell, LC)、黑色素細(xì)胞(melanocyte, MC)數(shù)量變化,及異體淋巴細(xì)胞混合試驗(yàn),揭示不同代角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞免疫原性的變化,為皮膚組織工程科學(xué)選擇種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: (1)0.25%分離酶,0.125%胰酶0.01%EDTA 兩步酶法分離包皮角質(zhì)形成細(xì)胞,按不同密度接種,K-SFM、FAD 培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別培養(yǎng),觀察原代融合生長(zhǎng)時(shí)間,傳代生長(zhǎng)情況。 (2)ATP 酶化學(xué)染色,免疫組化檢測(cè)各代角質(zhì)形成細(xì)胞中朗格漢斯細(xì)胞、黑色素細(xì)胞數(shù)量的變化。 (3)將凍存的不同代數(shù)人角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,分別與健康的同種異體志愿者的外周血淋巴細(xì)胞混合,建立異體細(xì)胞體外免疫排斥模型。通過H3-TdR 標(biāo)記,液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)異體淋巴細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果: (1)采用中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化的方法,真、表皮容易分離,臺(tái)盼蘭染色,活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的95%以上。原代角質(zhì)形成細(xì)胞接種密度在1×105/cm~2～5×105/cm~2 時(shí),細(xì)胞貼壁好,增殖速度快,體外培養(yǎng)周期顯著縮短。與FAD 培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較,K-SFM 培養(yǎng)的細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),數(shù)代后細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞仍然十分相似,且生長(zhǎng)較快。 (2)ATP 酶染色僅在表皮鋪片中呈陽性。免疫組化染色原代角質(zhì)形成細(xì)胞中混有5.8%朗格漢斯細(xì)胞和8.1%黑色素細(xì)胞,Ⅰ代角質(zhì)形成細(xì)胞中混有2.1%朗格漢斯細(xì)胞和2.8%黑色素細(xì)胞。從Ⅱ代開始,角質(zhì)形成細(xì)胞混雜的朗格漢斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞均消失。 (3)異體淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,cpm 值隨角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞代數(shù)增高,逐漸降低。原代、Ⅰ代角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞cpm 值下降明顯,Ⅱ代、Ⅲ代、Ⅳ
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2005
【中圖分類】：R751

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本文編號(hào)：2826049