汗腺是皮膚重要的附屬器之一,分為外泌汗腺和頂泌汗腺,其中外泌汗腺起著體溫調(diào)節(jié)、分泌、代謝等重要作用。它由小汗腺胚芽分化而成,胚胎24周時(shí)開始分泌汗液,乙酰膽堿引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加是人外泌汗腺腺上皮細(xì)胞分泌汗液的基礎(chǔ)。深入研究外泌汗腺的結(jié)構(gòu)和功能意義重大。第一,外泌汗腺分為分泌部和導(dǎo)管部,分泌部為無分支管狀腺,由單層腺上皮細(xì)胞和其外周的肌上皮細(xì)胞構(gòu)成,結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,但功能完整,體外培養(yǎng)外泌汗腺腺上皮細(xì)胞為深入研究其結(jié)構(gòu)功能提供了可能,也為其它外泌腺體分泌和重吸收機(jī)制的深入研究提供了重要模式;第二,外泌汗腺分泌部和導(dǎo)管部均是小管結(jié)構(gòu)組成,人體中還有許多器官含有小管結(jié)構(gòu),如血管、肝小管、腎小管、乳腺小管、胰腺小管等,小管起著分泌、吸收、重吸收、體液運(yùn)輸?shù)戎匾饔?研究表明,在小管發(fā)生過程中有一些共同的作用機(jī)制,因此,體外誘導(dǎo)外泌汗腺小管形成和三維重建汗腺不僅有利于研究汗腺的細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的相關(guān)問題,對(duì)研究其它器官的小管發(fā)生和體外重建也有借鑒和指導(dǎo)作用;第三,汗腺重建模型的建立將為外泌腺體藥理機(jī)制的基礎(chǔ)研究等提供工具;第四,皮膚缺損導(dǎo)致汗腺缺失或其它疾病導(dǎo)致汗腺結(jié)構(gòu)功能異常將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。組織工程皮膚發(fā)展至今,已基本解決了創(chuàng)面覆蓋的問題,但未達(dá)到真正的組織結(jié)構(gòu)和功能的完全重建,缺少毛囊、汗腺、皮脂腺等附屬器,從而不能完成排汗、分泌等重要功能。體外重建汗腺將為研究帶汗腺的組織工程皮膚奠定基礎(chǔ)。 上世紀(jì)90年代始,國(guó)內(nèi)外有研究者進(jìn)行了外泌汗腺細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究,均采用的是組織塊法,體外成功培養(yǎng)了外泌汗腺細(xì)胞,培養(yǎng)的細(xì)胞保持了上皮細(xì)胞的特點(diǎn)和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水的能力以及一些藥理學(xué)特性,如在擬膽堿能藥(如氯化氨甲酰膽堿)的刺激下培養(yǎng)的分泌部細(xì)胞能形成短回路電流,該作用能被鈉離子阻滯劑(阿米洛利)所抑制,這為從體外進(jìn)一步研究汗腺細(xì)胞的生理功能奠定了基礎(chǔ)。但其缺點(diǎn)在于獲得的細(xì)胞量少,所需培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),成纖維細(xì)胞污染嚴(yán)重,且從完整的汗腺中長(zhǎng)出的細(xì)胞包括導(dǎo)管部細(xì)胞和分泌部細(xì)胞,從形態(tài)上不能鑒別。另外,體外誘導(dǎo)汗腺小管形成、三維重建汗腺尚未見報(bào)道。因此,建立高效汗腺細(xì)胞分離培養(yǎng)方法,并探討其體外重
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R751
【部分圖文】：

、HGF 相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)利用 western blot 技術(shù)對(duì)加入 HGF 后 0min、5min、30min、90min、汗腺腺上皮細(xì)胞中 p-ERK1/2、p-AKT1/2/3、p-IκBα蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)信號(hào)通路是否活化及其時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在未加入 HGF 時(shí)，三種磷酸化，隨著時(shí)間的推移，ERK1/2、AKT1/2/3、IκBα均被顯著磷酸化，達(dá)到漸下降，但每個(gè)蛋白磷酸化高峰值時(shí)間不同：p-ERK1/2 在 HGF 刺激 5m高峰，RIOD 增加 8.1 倍(P<0.01)、p-AKT1/2/3 在 HGF 刺激 5min 時(shí)表達(dá)IOD 增加 12.8 倍(P<0.01)、p-IκBα在 HGF 刺激 90min 時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰7.2 倍(P< 0.01)。白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化作為傳遞外界各種信息的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，一系列的蛋白激酶及其磷酸化構(gòu)成了信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)的過程，各個(gè)信號(hào)通路之間不能截然分開(見圖了幾個(gè)在細(xì)胞生物學(xué)和小管形成上均有重要作用的信號(hào)通路，進(jìn)行初步觀

、 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞（團(tuán)）生長(zhǎng)：代細(xì)胞在 Matrigel 中能存活，24 小時(shí)后可見細(xì)胞伸展，倒置顯微鏡下觀圓形，中間有圓形核，接種后 3 天，大多細(xì)胞分裂成 2-4 個(gè)細(xì)胞組成的，聚焦平面細(xì)胞呈環(huán)狀排列結(jié)構(gòu)，直徑為 14.72±5.06μm；5 天后細(xì)胞.44±5.12μm，可見細(xì)胞約為 5-8 個(gè)，細(xì)胞之間互相連接形成囊性或管狀團(tuán)直徑為 50.83±9.92μm，可見細(xì)胞為大約 10 個(gè)；9 天后細(xì)胞團(tuán)直徑為2μm，可見細(xì)胞約為 20 個(gè)細(xì)胞；11 天后細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多，可見細(xì)胞團(tuán)球狀，直徑為 115.28±20.13μm，與外泌汗腺大體結(jié)構(gòu)觀察相似(照片 4-1后細(xì)胞團(tuán)直徑為 132.50±29.42μm。.膠原凝膠中細(xì)胞不伸展，不能形成細(xì)亡。Matrigel 中，前 9 天前細(xì)胞團(tuán)直徑平均每?jī)商煸鲩L(zhǎng)約一倍，每?jī)?，有顯著差異，但 9 天后增殖減慢，第 11 天和第 13 天之間無差異(P>可能與 Matrigel 中營(yíng)養(yǎng)成分消耗和細(xì)胞之間的接觸抑制有關(guān)。** ** ** ** **

白結(jié)合后激活信號(hào)通路示意圖，多條信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等，最終使細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)蛋白以直接連結(jié)在C-met的結(jié)合位點(diǎn)上或通過Grb2參與M形成中起了關(guān)鍵作用。有實(shí)驗(yàn)表明，在C-met突變不形成，但是當(dāng)過度表達(dá)Gab1時(shí)，其功能恢復(fù)，能意義的是，Gab1缺如的小鼠與HGF或C-met缺陷有導(dǎo)致的早期胚胎死亡，肝臟變小和肌前體細(xì)胞移時(shí)，Gab迅速酪氨酸磷酸化，產(chǎn)生多個(gè)SH2(Ssine binding)的結(jié)合位點(diǎn)，如SHP2酪氨酸磷酸酯酶、-γ)、SHIP-1磷脂酰肌醇 5’-磷酸酯酶和適配蛋白ab的這些下游分子中，只有充足的SHP2對(duì)分支發(fā)氨酸磷酸酯酶

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