【摘要】： 背景和目的 目前，銀屑病、特應(yīng)性皮炎(AD)以及白癜風(fēng)等免疫性皮膚病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但它們均與免疫炎癥有關(guān)，特別是皮損處炎癥更為顯著，這已經(jīng)成為共識(shí)。眾多炎癥細(xì)胞因子和細(xì)胞表面抗原分子在這類皮膚病中的參與組成一個(gè)龐大的免疫網(wǎng)絡(luò)，環(huán)環(huán)相扣，一旦某個(gè)或某些環(huán)節(jié)失衡，就會(huì)引起整個(gè)免疫網(wǎng)絡(luò)的紊亂，導(dǎo)致疾病發(fā)生，并直接影響病程、病情和臨床治療的選擇。 我們知道，紫外線(UV)與皮膚息息相關(guān)。皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)和黑素細(xì)胞(MC)是UV照射的重要靶位，臨床上采用窄譜中波紫外線治療上述皮膚病有一定療效，其作用機(jī)制一定程度上與其產(chǎn)生的免疫抑制作用有關(guān)。例如，UV照射可減少局部炎癥T細(xì)胞的浸潤(rùn)；激活抑制性T細(xì)胞發(fā)揮作用等等。此外，UV照射后皮損處細(xì)胞因子和細(xì)胞表面抗原表達(dá)的改變也使得炎癥介質(zhì)的效應(yīng)作用減弱。角質(zhì)形成細(xì)胞可分泌多種具有免疫抑制作用的介質(zhì)，其中，黑素細(xì)胞刺激素(α-MSH)的作用不可忽視。 α-MSH是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，它能由多種細(xì)胞合成分泌，是一種有效的免疫調(diào)節(jié)因子，能抑制多種免疫炎癥因子的產(chǎn)生和活性；能下調(diào)APC共刺激分子B7(CD80、CD86)的表達(dá)；能夠下調(diào)脂多糖或TNF-α誘導(dǎo)的CD54的表達(dá)；能抑制脂多糖或IL一1β介導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)等。 表面抗原分子CD40主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞，屬共刺激分子之一，1985年被認(rèn)識(shí)，1989年被完全克隆，1996、2002年分別被發(fā)現(xiàn)能低水平表達(dá)于正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞，IFN-γ能上調(diào)CD40在這兩種細(xì)胞表面的表達(dá)。CD40和它的配體CD40L(CD40L／(gp39))為體內(nèi)特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)一對(duì)重要的共刺激分子。CD40與gp39相互作用后，能加強(qiáng)KC炎癥介質(zhì)的釋放(如IL-8)和其它表面抗原(如CD54)的表達(dá)，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，即所謂的CD40／gp39途徑。有關(guān)CD40與KC方面的研究?jī)?nèi)容涉及KC增殖與分化、表皮腫瘤發(fā)生、免疫性、炎癥性及感染性皮膚病等；而CD40與MC相關(guān)的研究?jī)?nèi)容則較少。 由于IFN-γ是體外刺激上調(diào)白細(xì)胞表面分化抗原最為常用的細(xì)胞因子，在人體內(nèi)也確實(shí)發(fā)揮了該作用，因此，我們選擇它作為實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞表面抗原表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。 我們的研究目的：①采用不同劑量UVB照射上述兩種細(xì)胞，評(píng)估UVB對(duì)細(xì)胞作用的時(shí)間及劑量效應(yīng)，以倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞受損程度，細(xì)胞記數(shù)法記錄生長(zhǎng)曲線，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，比較人黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)中波紫外線輻射的應(yīng)激能力，并取適當(dāng)UVB輻射劑量，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供條件；②中波紫外線輻射對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響，即KC和MC表面能否表達(dá)CD40、CD54等分子，其表達(dá)能否被IFN-γ上調(diào)，UVB照射能否對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的KC和MC表面這些抗原分子表達(dá)產(chǎn)生影響以及UVB照射對(duì)KC和MCα-MSH分泌的時(shí)效性影響，探討UVB影響KC和MC抗原表達(dá)的可能機(jī)制；③中波紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響。綜上，為臨床UVB治療銀屑病、特應(yīng)性皮炎以及白癜風(fēng)等免疫性皮膚病提供部分理論依據(jù)。 方法 1．細(xì)胞培養(yǎng)：取健康青少年環(huán)切術(shù)后包皮，經(jīng)0.5％Dispase液4℃下消化18～20h。眼科鑷輕輕分離真表皮，含0.25％胰酶的消化液37℃消化表皮5min，再用含血清的培養(yǎng)基終止消化并離心后，按實(shí)驗(yàn)需要加入KC和MC培養(yǎng)基，每3天換液1次，1-2周后即能獲得純培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞。將細(xì)胞傳至2-3代用于實(shí)驗(yàn)。 2．紫外線照射：將原代黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞定量接種于96孔板和直徑10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。將亞融合狀態(tài)的培養(yǎng)細(xì)胞分為照光組和對(duì)照組，用臺(tái)式UVB照射儀對(duì)置于PBS里的細(xì)胞進(jìn)行照射(細(xì)胞距紫外光源15cm)。 3．光損傷的形態(tài)學(xué)觀察：UVB照射上述2種細(xì)胞后，于照射后24h、48h及72h時(shí)用倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，CH型)觀察各劑量照射組細(xì)胞的形態(tài)變化。 4．細(xì)胞計(jì)數(shù)法記錄細(xì)胞生長(zhǎng)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性：將細(xì)胞于照光后0、24、48、72h分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性檢測(cè)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞經(jīng)UVB照射后，每孔加入20μl濃度為5mg／ml的MTT，孵育4h，等量DMSO溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490nm處吸光值(A值)。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。 5．細(xì)胞表面抗原的測(cè)定：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)組，加入FITC標(biāo)記的CD40單抗10μl，重復(fù)的兩組細(xì)胞分別加入CD54和MHC-Ⅱ單抗各10μl，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。加有sCD40L孵育的各組只測(cè)CD54和MHC-Ⅱ。 6．上清液中α-MSH濃度的測(cè)定：采用放射免疫法(RIA)，樣本分空白組、300IU／mlIFN-γ組及30mJ／cm~2UVB等3組，分別在0、24、48、72和96h提取上清。檢測(cè)時(shí)，按說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行操作，最后在γ臺(tái)檢測(cè)沉淀物的放射活性。 7．上清液中IL-6、IL-8、TNF-α濃度的測(cè)定：收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液，按照ELIsA說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，測(cè)定上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。 8．統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)果 1．UVB照射后，KC的形態(tài)學(xué)改變、生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞活性的損傷程度隨照射劑量加大而加重；MC在較低劑量時(shí)無(wú)明顯受損，但達(dá)到一定劑量后其損傷程度亦隨照射劑量加大而加重。另經(jīng)30mJ／cm~2照射孵育24h、48h及72h后，分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間段的細(xì)胞活性比值比較(72h／48h，72h／24h)，發(fā)現(xiàn)KC活性比依次遞減(分別為1.81和1.23)；MC的活性比則相反(分別為0.94和1.01)。 2．NHK表面能低水平表達(dá)CD40等表面抗原，IFN-γ處理后，細(xì)胞活性增強(qiáng)，表面抗原的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)；UVB輻射后，細(xì)胞活性下降，表面抗原的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，而上清液中α-MSH的濃度則逐漸上升，照后72h達(dá)最高峰(P＜0.01)，變化與表面抗原的表達(dá)呈相反趨勢(shì)。此外，NHK經(jīng)可溶性CD40配體(sCD40L)配基化后，IL-8的釋放和CD54分子的表達(dá)得到放大，且表現(xiàn)為CD40特異性，該情況能被sCD40L特異性單抗所阻斷。 3．MC表面亦能低水平表達(dá)CD40，IFN-γ能上調(diào)其表達(dá)，UVB輻射對(duì)表面抗原的表達(dá)和上清液中α-MSH的濃度無(wú)顯著影響。UVB輻射后的人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液能下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞表面CD40等抗原分子的表達(dá)。 結(jié)論 1．低劑量UVB照射后，KC輕度受損；MC則活性反而增強(qiáng)；較高劑量UVB照射后，MC和KC均有不同程度受損，KC的損傷程度隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而加重，而MC仍可在48h得到恢復(fù)。故MC對(duì)UVB的應(yīng)激能力較KC強(qiáng)。 2．UVB能顯著抑制IFN-γ誘導(dǎo)的NHK CD40等表面抗原的表達(dá)，這可能與UVB使NHK自分泌產(chǎn)生a-MSH等免疫抑制物有關(guān)；UVB不能直接對(duì)MC表面抗原的表達(dá)產(chǎn)生影響，但可通過(guò)KC分泌α-MSH等免疫抑制物間接抑制IFN-γ誘導(dǎo)的MC表面CD40等抗原分子的表達(dá)。CD40參與了眾多免疫性皮膚病的發(fā)生和發(fā)展，UVB是一項(xiàng)干預(yù)CD40過(guò)表達(dá)的有效手段。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R751
【圖文】：

3B，多巴染色使黑素細(xì)胞胞漿和樹(shù)突呈棕揭色，胞核呈棕紅色;S一100免疫組化DAB染色使黑素細(xì)胞胞漿呈棕褐色

等劑量UVB照射后24h內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，此后受損變化較緩，并有逐漸恢復(fù)跡象。黑素細(xì)胞在接受小至中等劑量uvB處理后無(wú)明顯受損，胞體增大，其樹(shù)突反而增多和加長(zhǎng)(圖5);但在較高劑量UVB(60一 90mJ/cmZ)處理后，開(kāi)始出現(xiàn)類似于角質(zhì)形成細(xì)胞受損時(shí)的情況，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹和空泡化、樹(shù)突減少并縮短，其損傷程度亦呈劑量依賴性，但在照后48h內(nèi)可逐漸恢復(fù)活性;而高劑量UvB(>9O

亞融合狀態(tài)的兩種細(xì)胞在接受不同劑量(30、60、90、120mJ/cm“)UVB照射24h后發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞受到不同程度的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞碎片增多，部分漂浮于培養(yǎng)液中(圖4)。以120mjlc時(shí)uvB損傷作用最強(qiáng)， 30mjlcmZ的uvB損傷變化最輕。此外，在經(jīng)小至中等劑量UVB照射后24h內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯下降，此后受損變化較緩，并有逐漸恢復(fù)跡象。黑素細(xì)胞在接受小至中等劑量uvB處理后無(wú)明顯受損，胞體增大，其樹(shù)突反而增多和加長(zhǎng)(圖5);但在較高劑量UVB(60一 90mJ/cmZ)處理后，開(kāi)始出現(xiàn)類似于角質(zhì)形成細(xì)胞受損時(shí)的情況，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹和空泡化、樹(shù)突減少并縮短，其損傷程度亦呈劑量依賴性，但在照后48h內(nèi)可逐漸恢復(fù)活性;而高劑量UvB(>9O

【參考文獻(xiàn)】

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1 閔瑋,駱丹,林向飛,繆旭,吉璽,朱潔;中波紫外線輻射對(duì)原代及永生化角質(zhì)形成細(xì)胞損傷能力的比較研究[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2004年06期

2 駱丹,閔瑋,林向飛,吳迪;角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)中波紫外線照射應(yīng)激能力的比較研究[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2004年05期

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本文編號(hào)：2793911