抗體芯片技術及其在肝癌和銀屑病標志物研究中的應用

發(fā)布時間：2020-08-14 07:51

【摘要】：疾病早期診斷和有效治療的關鍵之一是能否找到指示疾病發(fā)生和發(fā)展的標志物分子,如何尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物分子是精準醫(yī)學發(fā)展的重要途徑。血清和血漿含有豐富的生物信息,可反映人體生理和病理狀況的變化,是理想的用于疾病生物標志物篩選的樣本來源。抗體芯片技術具有高通量、高靈敏度的特點,適用于血清和血漿中低豐度蛋白質的檢測,而數(shù)據(jù)獨立采集質譜(Data-independent acquisition mass spectrometry,DIA-MS)技術對血液蛋白質組的檢測具有很高的通量和覆蓋率。本文首先運用抗體芯片技術對肝病血清樣本進行檢測,初步篩選出指示肝癌發(fā)生和發(fā)展的潛在生物標志物。然后通過結合抗體芯片技術和DIA-MS技術建立的深度血清蛋白質組學平臺,探索銀屑病發(fā)病期間蛋白質水平的變化及其與臨床信息的關系。具體工作如下:1.本研究開展了基于高密度抗體芯片技術檢測肝癌的血清蛋白質表達圖譜和潛在生物標志物的工作。首先,運用由1000個血清蛋白質的抗體組成的抗體芯片以及生物素標記血清的策略對健康人和乙型肝炎、肝硬化、肝癌(AFP陰性)四組樣本的血清蛋白表達圖譜進行檢測,并通過one-way ANOVA統(tǒng)計學方法分析差異蛋白。然后,用本實驗室點制的小型芯片對檢測的差異蛋白進行多重驗證,發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、癌胚抗原125(Carcinoembryonic antigen125,CA125)、Myc誘導核抗原(Myc-induced nuclear antigen,MINA)和D-二聚體(D-Dimer)在疾病組和健康組中有顯著差異,其中MINA和D-Dimer分別與肝硬化和肝癌密切相關。表明該抗體芯片技術可用于肝癌血清蛋白表達圖譜的檢測,且具有很好的重復性和特異性。另外,生存曲線分析發(fā)現(xiàn)MINA和D-Dimer對于肝癌可能具有一定的預后價值。說明通過抗體芯片的方法可以初步篩選出具有臨床診斷意義的肝癌血清標志物,為進一步開展臨床驗證實驗奠定基礎。2.本研究工作聯(lián)合DIA-MS技術和可定制抗體芯片技術開發(fā)了一種深度血清蛋白質組學研究平臺,對血清蛋白質組的檢測范圍可跨越10個數(shù)量級。通過對50例健康對照和中藥銀屑靈治療前后銀屑病患者血清樣本的檢測,在銀屑病患者中鑒定了106種參與銀屑病相關生物過程的差異表達蛋白質,如凝血、炎癥、細胞凋亡和血管生成等信號通路。此外,無偏差聚類分析和主成分分析結果顯示,其中的58種蛋白質能夠完全區(qū)分健康對照和銀屑病患者,12種蛋白質能夠完全區(qū)分銀屑靈治療響應者和無響應者。為了進一步證明我們檢測平臺的臨床效用,通過對血清蛋白質組、臨床信息和銀屑病嚴重程度指數(shù)進行相關性分析,發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)(Psoriasis area and severity index,PASI)評分與彈性蛋白酶抑制劑(Elafin,PI3)、C-C趨化因子22(C-C motif chemokine22,CCL22)和白細胞介素12B(Interleukin-12 subunit beta,IL12B)三種血清蛋白呈正相關。研究結果證明,我們的深度血清蛋白質組學平臺可以用于銀屑病及其他疾病早期診斷和個體化用藥生物標志物的篩選,具有廣闊的臨床應用前景。
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;R758.63;O657
【圖文】：

血液蛋白質,研究背景,豐度,蛋白

有低侵襲性、簡單快速和低成本等優(yōu)點，是理想的用于篩選疾病診斷和治療生物逡逑標志物分子的樣本來源。然而血液中不僅包含濃度達ｍｇ／ｍｌ的高豐度蛋白，還包含逡逑濃度在ｐｇ／ｍｌ以下的低豐度蛋白（圖１．１）邋ｉ８ｉ，在檢測中，低豐度蛋白的信號很容易逡逑被高豐度蛋白掩蓋，據(jù)報道只有約５°／。的腫瘤組織蛋白可以在血漿中被檢測到１９】，逡逑因此如何實現(xiàn)對血液蛋白質組檢測范圍的高度覆蓋，同時定量檢測血液中的低豐逡逑度蛋白面臨著巨大的挑戰(zhàn)。逡逑ＩｇＧ逡逑轉鐵蛋白逡逑贏邐ＩｇＡ邐脂蛋白ａ逡逑／ｄ邐＾１＾（４邐ａｌ酸性糖蛋白逡逑，二＿邋Ｖ邐佭如八１逡逑魯．ｉ邐＾ｃｉｑ逡逑Ｉ邐？ｉ00／？其它邐ｓ逡逑白蛋白邐ｖ：：：ｆ邐血刪藍焌逡逑圍子逡逑圖１．１邋２２種人血漿高豐度蛋白逡逑１．１血液蛋白質組學研究背景逡逑２００２年安德森最早提出了血漿蛋白大綱１５］，文章列出了血液中的２８９種蛋白質，逡逑并描繪了正常血漿中豐度超過１０個數(shù)量級的血漿蛋白，并將其大致分為經(jīng)典血漿逡逑蛋白、組織間隙產(chǎn)物、細胞因子以及其他低豐度蛋白。２００３年，人類血漿蛋白質逡逑組計劃（Ｈｕｍａｎ邋Ｐｌａｓｍａ邋Ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＰＰＰ）通過在３５個不同的實驗室中對高逡逑加索人、非洲裔美國人和亞裔美國人的一系列血清和血漿樣本進行質譜分析

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１．２血液蛋白質組學技術逡逑由于血漿蛋白的成分復雜、蛋白濃度動態(tài)范圍廣泛，而且存在很多高豐度蛋逡逑白，因此對血漿蛋白進行分析的技術面臨挑戰(zhàn)。如圖１．２所示，目前血漿蛋白分析逡逑的基本策略主要分為三種：去除高豐度蛋白、對血漿蛋白／肽段進行預分離以及對逡逑血漿中某些組分的蛋白／肽段進行富集，除此之外，還有針對血漿中多肽和自身抗逡逑體的檢測方法。逡逑抗體ＩＨ免疫蛋白質組分折、蛋白質芯片逡逑訂邋邐邋邐逡逑「血團邋Ｉ邐團多肽丨一［ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ｉ逡逑（Ｉ逡逑血漿去除高半度逍勺Ｉ一邋ｆ蛋白富集Ｉ邋一邋Ｉ＂蛋白預分離逡逑抗體芯片｜邐｜肽段預分離Ｉ—肽段富集切為肽段逡逑質譜檢測逡逑圖１．２血漿蛋白質組研究常見的研究策略逡逑１．２．１基于質譜的血液蛋白質組學研宄逡逑質譜技術因其高通量、高靈敏度等特點己經(jīng)成為目前蛋白質組研究的主要技逡逑術［２５］�；谫|譜的蛋白質組實驗及分析流程如圖丨．３所示。（１）實驗設計：生物逡逑樣本制備、蛋白質的提取、分離與酶解、肽段分離及質譜分析等；（２）數(shù)據(jù)分析：逡逑包含質譜數(shù)據(jù)分析及對質譜定量結果的統(tǒng)計與生物學分析；（３）質譜數(shù)據(jù)分析：逡逑質譜的鑒定與質控、肽段與蛋白質的定量分析；（４）統(tǒng)計學與生物學分析：依據(jù)逡逑實驗設計的區(qū)別選用合適的統(tǒng)計方法確定實驗組別間的差異表達蛋白質逡逑（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＤＥＰｓ）、依據(jù)差異表達蛋白質進行功能富集等逡逑生物學分析及可視化。逡逑質譜技術起源于２０世紀５０年代的Ｅｄｍａｎ降解蛋白質測序技術，０前我們熟知逡逑的多維液相色譜－離子阱串聯(lián)質譜技術（也稱鳥槍法蛋白質組學

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