【摘要】：背景:白癜風是黑素細胞被破壞所致的色素脫失性皮膚病,其發(fā)病機制尚未充分闡明。大量研究表明,氧化應激在白癜風發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用,可直接導致黑素細胞凋亡,亦可繼而誘發(fā)自身免疫反應破壞黑素細胞,是白癜風發(fā)病的始動環(huán)節(jié)。多種因素共同作用可打破黑素細胞氧化-抗氧化平衡,致使活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)過量蓄積,介導DNA、蛋白、脂類及線粒體等發(fā)生過氧化反應。其中,嚴重的線粒體氧化損傷可直接激活凋亡途徑,誘發(fā)黑素細胞凋亡,在白癜風氧化應激發(fā)病中發(fā)揮重要作用。然而,目前關于白癜風線粒體損傷的分子機制尚未闡明,深入研究線粒體氧化損傷修復的關鍵信號通路及靶點,對于保護黑素細胞對抗氧化應激損傷以及防治白癜風具有重要意義。芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控數(shù)百種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達,進而發(fā)揮多種重要的生物學功能。AHR能夠修復線粒體氧化損傷,減少線粒體介導的細胞凋亡,但具體的分子機制仍不清楚。近期研究報道,白癜風患者皮損組織中AHR及下游靶基因表達顯著降低,提示白癜風中AHR信號通路可能存在異常。因此,我們提出一新的研究假說:AHR信號通路在保護線粒體功能對抗黑素細胞氧化損傷中具有重要作用;當該通路異常時,細胞無法有效緩解線粒體氧化損傷,導致黑素細胞凋亡增加,誘發(fā)白癜風發(fā)生。目的:1.分析AHR信號通路異常的遺傳背景機制及其在白癜風發(fā)病中的作用。2.明確AHR信號通路在保護線粒體對抗黑素細胞氧化應激損傷的分子機制。方法:1.通過分子流行病學研究及相關功能學研究,觀察AHR基因多態(tài)性與白癜風罹患風險的相關性及其分子機制。2.應用AHR配體處理正常人黑素細胞系PIG1,觀察AHR信號通路活化情況。3.利用H2O2孵育PIG1細胞構建氧化應激模型,觀察氧化應激條件下黑素細胞PIG1中AHR信號通路活化情況。4.應用AHR信號通路抑制劑CH223191或AHR激活劑FICZ及H2O2共處理PIG1細胞,觀察氧化應激條件下AHR信號通路對黑素細胞內(nèi)總ROS水平、細胞凋亡及生長周期的影響。5.應用CH223191或FICZ及H2O2共處理PIG1細胞,觀察氧化應激條件下AHR信號通路對黑素細胞線粒體內(nèi)膜ROS水平、線粒體膜電位、ATP合成水平、線粒體DNA水平以及線粒體損傷修復相關分子表達水平的影響。6.觀察白癜風黑素細胞系PIG3V及白癜風患者外周血單個核細胞中AHR表達情況及AHR信號通路激活情況。結果及意義:1.AHR基因遺傳多態(tài)性與白癜風易感性密切相關;位于AHR啟動子區(qū)的rs10249788位點能夠影響轉(zhuǎn)錄因子SP1與AHR啟動子區(qū)的結合,進而影響AHR基因轉(zhuǎn)錄活性;白癜風患者外周血單個核細胞中AHR及SP1的m RNA表達水平均顯著下調(diào),且rs10249788位點能夠影響個體AHR基因表達水平。2.AHR激活劑可上調(diào)PIG1細胞中AHR信號通路下游靶基因CYP1A1及CYP1B1的m RNA表達水平,提示正常人黑素細胞存在功能性AHR信號通路。3.H2O2可促進PIG1細胞中AHR發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并能夠上調(diào)CYP1A1及CYP1B1的m RNA及蛋白表達水平;AHR信號通路特異性抑制劑CH223191能夠抑制上述作用;上述結果提示H2O2可促進正常人黑素細胞中AHR信號通路激活。4.氧化應激條件下,抑制AHR信號通路后PIG1細胞生長停滯、胞內(nèi)總ROS水平明顯升高、晚期凋亡率顯著升高;上述結果提示氧化應激條件下抑制AHR信號通路可加重黑素細胞氧化損傷。5.氧化應激條件下,抑制AHR信號通路后PIG1細胞線粒體ROS水平明顯升高、線粒體膜電位顯著降低、ATP合成水平顯著降低、線粒體DNA含量明顯減少;而進一步激活AHR信號通路后PIG1細胞線粒體ATP合成水平及線粒體DNA水平均顯著升高;此外,調(diào)控AHR信號通路能夠影響線粒體生物合成調(diào)控分子Nfr1及其下游Tfam、CYCS的表達水平,而對于細胞或線粒體自噬沒有明顯影響;上述結果提示氧化應激條件下抑制AHR信號通路可加重線粒體氧化損傷,激活AHR信號通路能夠促進線粒體生物合成過程。6.白癜風黑素細胞系PIG3V中AHR蛋白表達水平顯著降低,H2O2處理PIG3V細胞后CYP1A1蛋白表達水平無明顯變化,提示氧化應激條件下白癜風黑素細胞中AHR表達異常且存在激活障礙;白癜風患者外周血單個核細胞中AHR的m RNA表達水平顯著下調(diào),且與疾病嚴重程度密切相關。結論:本研究首次明確AHR基因遺傳變異可影響AHR轉(zhuǎn)錄表達,與白癜風易感性密切相關;在氧化應激條件下,AHR表達異�？蓪е翧HR信號通路激活障礙,影響下游線粒體生物合成及線粒體損傷修復過程,導致線粒體介導的黑素細胞凋亡增加,從而參與白癜風黑素細胞氧化應激損傷過程。本研究意義在于:深入認識AHR信號通路的生物學功能;初步闡述線粒體氧化損傷修復的新機制;明確AHR信號通路在保護黑素細胞對抗氧化應激損傷中的重要作用,為指導白癜風治療提供新的理論依據(jù)及策略。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R758.41

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本文編號：2781062