【摘要】： 【目的】 以Balb/c小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型及刺激性接觸性皮炎(ICD)模型,研究外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)皮膚炎癥反應(yīng)的抑制作用,觀察其對(duì)T細(xì)胞的作用,闡明抗炎機(jī)制,為研制新型抗皮膚炎癥外用藥物提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。 【方法】 1.運(yùn)用Franz垂直擴(kuò)散池進(jìn)行Z-VAD-FMK的體外透皮研究,高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)藥物含量;同時(shí)對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)透皮研究,局部外用Z-VAD-FMK后將皮膚離體,以乙二醇去除表皮,剩余組織經(jīng)液氮研磨組織勻漿,以液相色譜—串連質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)藥物濃度。 2.以1-氟-2,4-二硝基苯(DNFB)制作經(jīng)典ACD小鼠模型,取激發(fā)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)經(jīng)典ACD小鼠模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行探討。 3.以DNFB制作初次ACD小鼠模型,數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量耳腫度隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化,ELISA方法檢測(cè)耳組織內(nèi)Th1細(xì)胞因子IL-2、INF-γ及Th2細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水平,Real time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞的增殖活性及表面活化標(biāo)記,從上述方面對(duì)初次ACD小鼠模型與經(jīng)典ACD小鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)比較。 4.以經(jīng)典ACD小鼠模型及初次ACD模型,觀察外用Z-VAD-FMK對(duì)ACD的治療作用、對(duì)ACD激發(fā)的抑制作用及對(duì)ACD誘導(dǎo)的抑制作用。 5.以ELISA方法檢測(cè)Z-VAD-FMK干預(yù)ACD治療、ACD激發(fā)及ACD誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中耳組織內(nèi)Th1細(xì)胞因子IL-2與INF-γ的表達(dá)水平,以real-time RT-PCR方法檢測(cè)耳組織內(nèi)IL-2 mRNA與INF-γmRNA的水平。 6.進(jìn)行小鼠局部淋巴結(jié)分析(LLNA),以BrdU—流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外用Z-VAD-FMK對(duì)耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的影響; 7.以巴豆油制作小鼠ICD模型,觀察外用Z-VAD-FMK對(duì)ICD的抑制作用。 【結(jié)果】 1.體外透皮研究中,在Franz垂直擴(kuò)散池供給池為20mM Z-VAD-FMK 200μl、接收池為4ml 0.9%NaCl、有效擴(kuò)散面積為1cm~2的條件下,Z-VAD-FMK 6h、12h及24h的透皮率分別為5.35%、15.52%及22.76%;體內(nèi)透皮研究中,間隔12h的2次外用2.5mM Z-VAD-FMK 15μl后,其在耳組織中的濃度可達(dá)100μM,這與體外實(shí)驗(yàn)中的有效濃度相近。 2.經(jīng)典ACD中,與激發(fā)后耳腫度一樣,激發(fā)后雙側(cè)耳重量之差與激發(fā)后組織切片顯微鏡下同一位置左右側(cè)耳雙面距離之差這2種客觀性更強(qiáng)的指標(biāo)亦顯示出一致的隨時(shí)間變化趨勢(shì),即:激發(fā)后(1-2)d,炎癥程度達(dá)到高峰,隨后逐漸減弱,4d后已減至一半左右。 3.初次ACD小鼠模型耳背部用藥6d后出現(xiàn)較明顯的耳腫度變化,這與經(jīng)典ACD模型自誘導(dǎo)至炎癥出現(xiàn)的時(shí)間相同;與經(jīng)典ACD小鼠模型相似,初次ACD模型的耳腫度亦呈現(xiàn)出隨時(shí)間變化的趨勢(shì):用藥后(7-8)d,耳腫度達(dá)到高峰,隨后逐漸減弱,9d后已減至一半左右;二者耳組織中的浸潤細(xì)胞均以單一核細(xì)胞為主;與正常對(duì)照相比,二者耳組織中Th1型細(xì)胞因子IL-2與INF-γ的表達(dá)均增加,其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Th2型細(xì)胞因子IL-4均未增加,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常對(duì)照相比,二者耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞摻入的BrdU的熒光強(qiáng)度均增高,T淋巴細(xì)胞3種表面活化標(biāo)記(CD69、CD25及Ia)陽性細(xì)胞的百分率亦均升高,其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.將Z-VAD-FMK外用于ACD小鼠模型,與陰性對(duì)照相比,激發(fā)后2h用藥、激發(fā)前用藥及誘導(dǎo)前用藥這3種情況下ACD觀察指標(biāo)均下降,其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.上述3種情況下,與陰性對(duì)照相比,Z-VAD-FMK處理組耳組織中IL-2與INF-γ的表達(dá)均減少,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.LLNA中,與陰性對(duì)照相比,Z-VAD-FMK處理組耳引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞摻入的BrdU的熒光強(qiáng)度均減弱,T細(xì)胞3種表面活化標(biāo)記(CD69、CD25及Ia)陽性細(xì)胞的百分率亦均下降,其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7.在干預(yù)ICD的實(shí)驗(yàn)中,無論是治療研究還是預(yù)防研究,與陰性對(duì)照相比,Z-VAD-FMK處理組3個(gè)觀察指標(biāo)的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 【結(jié)論】 1.廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)皮膚有一定的通透性,為其作為皮膚外用藥物提供了可能。 2.經(jīng)典ACD小鼠模型與初次ACD小鼠模型均為Th1型免疫反應(yīng),二者在臨床、組織病理學(xué)、組織中細(xì)胞因子表達(dá)及局部引流淋巴結(jié)中的表現(xiàn)均相似,可以互用,從而豐富了ACD小鼠模型,為研究抗炎、抗免疫新藥提供了新的模型選擇。 3.外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以有效抑制ACD的發(fā)生,其對(duì)ACD的誘導(dǎo)及激發(fā)亦均有抑制作用。 4.外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK對(duì)巴豆油引起的ICD無明顯抑制作用,提示其抗刺激性炎癥的作用較弱。 5.外用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以抑制皮膚及局部引流淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞的增殖與活化,從而有效抑制ACD的發(fā)生。 6.為了能更好地利用廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK局部外用的抗炎作用,需進(jìn)行試劑的進(jìn)一步研制,使其盡可能擺脫DMSO的影響,并對(duì)其劑型進(jìn)行優(yōu)化,增強(qiáng)透皮作用,從而將其抗皮膚炎癥作用發(fā)揮到最大。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R758.2
【圖文】：

HPLC檢測(cè)Z~VAD一FMK含量

體內(nèi)透皮實(shí)驗(yàn)中，以LC一MS從S檢測(cè)Z~VAD一FMK含量，采用的分析柱為e即 eellels(2.lmmxloomm，5協(xié)m)，流動(dòng)相乙睛一0.1%甲酸/水(30:70)。結(jié)果顯示，質(zhì)核比(耐z)為468.2處出現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)(圖1一ZA);隨后，設(shè)立離子通道 468.1/305.1amu進(jìn)行檢測(cè)，吸收峰出現(xiàn)在進(jìn)樣后Zmin左右(圖1一ZB);而陰性對(duì)照含等量DMSO的20%甲醇(圖1一ZC)與正常鼠耳組織(圖1一ZD)均未出現(xiàn)吸收峰。

本文編號(hào)：2776504