【摘要】： 目的 皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和基底細(xì)胞癌(basal cellcarcinoma,BCC)的發(fā)生是多因素、多階段、多基因共同作用所致,涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。用DNA多態(tài)性標(biāo)記腫瘤染色體特定位點(diǎn),分析其雜合性丟失(loSS of heterozygosity,LOH)已廣泛用于抑癌基因(tumor suppressorgene,TSG)的篩選和機(jī)制的研究。SCC與BCC有著不同的生物學(xué)行為和病理學(xué)特征,提示這兩種腫瘤的發(fā)生機(jī)制不盡相同,因此探討SCC與BCC相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以為臨床診療提供標(biāo)記物。PTCH1(human homolog of the Drosophila pathed1,PTCH1)為TSG表達(dá)的一種蛋白,在多種腫瘤發(fā)生的Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用;因此有必要探討其在SCC、BCC表達(dá)情況,為SCC、BCC的診斷和治療提供可能的分子靶標(biāo)。 近來LOH研究顯示染色體9p21-22和9q22-23缺失頻率較高,提示9p21-22和9q22-23內(nèi)可能存在與SCC、BCC發(fā)生有關(guān)的抑癌基因。為證實(shí)SCC、BCC與9號染色體雜合性丟失的相關(guān)性,本研究利用激光捕獲顯微切割(laser capturemicrodissection,LCM)技術(shù)特異性捕獲腫瘤細(xì)胞,將其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與外周血DNA的PCR產(chǎn)物對比進(jìn)行LOH分析。本研究選擇了5個微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記,3個位于9p21-22區(qū)域,2個位于9q22-23區(qū)域,分析26例BCC和10例SCC的LOH缺失情況,以期確定其是否與腫瘤發(fā)生有關(guān)。并進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析PTCH1蛋白在SCC及BCC中的表達(dá)情況及意義。 方法 LOH樣本:26例BCC,10例SCC新鮮組織標(biāo)本,OCT包埋,-80℃保存?zhèn)溆?診斷均經(jīng)病理證實(shí)。顯微切割特異性捕獲腫瘤細(xì)胞:7μm連續(xù)冷凍切片,采用SLμCut顯微分離系統(tǒng)捕獲腫瘤細(xì)胞約4000個。腫瘤細(xì)胞DNA的提取與PCR擴(kuò)增:腫瘤細(xì)胞DNA的提取參照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書,對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記的選擇參考文獻(xiàn)報道,從UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫獲得微衛(wèi)星序列。LOH分析:取10μlPCR產(chǎn)物與10μl甲酰胺上樣緩沖液混合,95℃變性10min,冰冷5分鐘。加樣10μl于8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(含7M尿素),80v電泳2.5h,硝酸銀染色,觀察等位片段大小和信號強(qiáng)度,判斷結(jié)果。與正常組織相比,癌組織條帶消失或相對密度減少50%以上時判斷為LOH。若癌組織條帶增多或位移則判斷為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)。 免疫組織化學(xué):標(biāo)本8例BCC,26例SCC,5例正常皮膚石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,PTCH1抗體購自北京奧維亞生物技術(shù)公司,稀釋濃度為1:200,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木蘇復(fù)染,胞內(nèi)見均一的棕黃色顆粒為陽性。400倍鏡下計數(shù)5個視野或者1000個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù),染色細(xì)胞≥20%為陽性,實(shí)驗數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS13.0進(jìn)行x~2驗檢分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 一、26例BCC的5個位點(diǎn)中,D9S196 LOH頻率為11.5%(3/26),D9S916為7.7%(2/26),D9S974MSI為15.4%(4/26),D9S1814LOH的頻率為最高15.4%(4/26),D9S176未發(fā)現(xiàn)LOH及MSI. 二、10例SCC雜合性丟失研究顯示:D9S974 MSI為10%(1/10),D9S176、D9S1814、D9S196及D9S916均未見LOH及MSI。 三、免疫組化染色:5例正常皮膚陽性率為20%(1/5),8例BCC均為陽性100%,28例SCC陽性率為92.3%(24/26)。 結(jié)論 一、在BCC中,與D9S1814連鎖的P15基因,D9S974連鎖的P16基因,可能與BCC的發(fā)生相關(guān)。 二、PTCH1基因內(nèi)D9S176及D9S196兩個微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記的LOH頻率明顯低于國外,推測其在SCC、BCC的發(fā)生中可能存在種族差異。 三、BCC與SCC在9號染色體發(fā)生LOH位點(diǎn)不同,兩者機(jī)制不同。 四、SCC、BCC與正常皮膚相LLPTCH1蛋白高表達(dá),均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),SCC與BCC之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。PTCH1高表達(dá)可通過激活Hedgehog信號通路在SCC、BCC發(fā)生過程起重要作用。 五、不同病理分期的SCC中PTCH1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5
【圖文】：

M1MZM3M4MSMarker圖2，瓊脂糖電泳結(jié)果(PCR擴(kuò)增引物分別為MI，DgSg16;MZ，D959M3，DgS176;M4，DgS1814;MS，Dgsl96)二)雜合性丟失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測結(jié)果28例BCC的5個位點(diǎn)中，DgS196的[JOH頻率為14.3%(4/28)，DgSgl1%(2/28)，DgS974MSI為11.1%(3/27)，Dgslsl4LOH的頻率為最高14.3%(4/2S176未發(fā)現(xiàn)LOH及MSI。10例SCC等位基因不平衡研究顯示:DgS176MSI為10%(l/10)，DgSgl6的10%(l/10)，D95974MSI為20%(2/10)。D951814及Dgsl96均未見LO于l及M表3，BCC和SCCLOH及MSI發(fā)生率位點(diǎn)BCCSCCLOHMSI信息個體數(shù)LO卜I%MSI%LOHMSI信息個體數(shù)LOH%MS17600260000100

LOH一 DgS196(片段缺失)LOH一 DgS1814(染色減弱)LOH一 DgSg16(片段缺失)MSI一D95974(片段增加)圖3一3變性聚丙烯酸胺凝膠電泳結(jié)果(T:BCC腫瘤組織;N:正常組織)二、免疫組化PTCHI在病變組織及臨近表皮均成強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性染色定位與胞漿。正常

PTCHI在111級鱗癌胞漿內(nèi)成強(qiáng)陽性表達(dá)，并見大量核異形和核分裂相(X4OO)

【參考文獻(xiàn)】

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1 白育萍;劉海燕;高瀅;劉玉峰;李承新;;皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中Ptch-1及Gli-1表達(dá)的檢測[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年07期

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本文編號：2754230