【摘要】： 目的:腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān),也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosi s protein,IAP)是一類內(nèi)源性細(xì)胞抑制因子,其過度表達(dá)引起凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。因此以IAP為靶點(diǎn),尋找治療惡性腫瘤的新途徑,成為當(dāng)今腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。Livin是IAP家族成員之一,Vucic等因該基因在人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá),又稱之為ML-IAP(melanomaIAP),特異的分布于多種腫瘤組織,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥相關(guān),將可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對(duì)人livin基因的小干擾RNA表達(dá)載體,觀察對(duì)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞凋亡和周期的影響,為探索惡性黑素瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:研究對(duì)象為人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株。采用:(1)基因克隆技術(shù)構(gòu)建pGPU6-GFP-livin-shRNA表達(dá)載體。(2)通過培養(yǎng)A375細(xì)胞、細(xì)胞轉(zhuǎn)染,利用熒光顯微鏡觀察pGPU6-GFP-livin-shRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。(3)分別獲取子組(空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2)總RNA,采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后livin mRNA的表達(dá)變化情況。(4)通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染,用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)A375細(xì)胞的凋亡情況。(5)PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況。結(jié)果:(1)采用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建pGPU6-GFP-livin-shRNA表達(dá)載體,并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。(2)熒光定量PCR結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的A375細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h livin mRNA表達(dá)量分別下降了17%和42%,轉(zhuǎn)染后72h livin mRNA表達(dá)量分別下降了71%和61%,48h到72h干擾片段的沉默效應(yīng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48h A375細(xì)胞凋亡率:實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2(31.00±2.25%和34.72±1.29%)高于空白組(3.21±2.10%)(P＜0.05),脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組(7.67±1.34%和6.84±1.34%)與空白組相比無差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染后72h A375細(xì)胞凋亡率:實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2(34.90±1.71%和38.59±1.31%)高于空白組(3.87±3.04%)(P＜0.05),陰性對(duì)照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(7.44±1.69%和7.89±1.44)與空白組相比無差異(P＞0.05)。(4)PI單染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48h,shRNA-2可引起G_0/G_1期細(xì)胞數(shù)升高,S期細(xì)胞數(shù)下降,siRNA-1作用不明顯,轉(zhuǎn)然后72h shRNA-1、2均能引起引起G_0/G_1期細(xì)胞數(shù)升高,S期細(xì)胞數(shù)下降。結(jié)論:(1)設(shè)計(jì)出針對(duì)livin共有序列的發(fā)卡樣shRNA寡核苷酸片段。(2)成功構(gòu)建出針對(duì)livin的shRNA表達(dá)載體pGPU6-GFP-livin-shRNA-1、pGPU6-GFP-livin-shRNA-2。(3)shRNA-1和2均能減少A375細(xì)胞中l(wèi)ivin mRNA的表達(dá)。(4)shRNA-1和2均能促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡。(5)shRNA-1和2均能使A375細(xì)胞周期出現(xiàn)G_0/G_1期阻滯,細(xì)胞增殖受到抑制,但調(diào)控細(xì)胞周期的作用時(shí)間點(diǎn)不同。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R739.5
【圖文】：

圖2.4.2pGPU6一即一shRNA載體的構(gòu)建圖譜Figure2.4.2PGPU6{FP一shRNAveetormaP2.4.2所示:pGpU6一GFp載體共有5117飾，BamHx位于第1663位堿基，萬bsl位于第172BamHI/Bbsl雙酶切后，在T4DNA連接酶的作用下，shR到A寡核昔酸模板連接于pGPu載體。重組體的轉(zhuǎn)化取8釁的稀釋后連接體系與100貝己制備的感受態(tài)細(xì)胞TMIOg，輕旋混勻，冰in，45oC熱沖擊1.smin，然后快速置于冰上lmin，加800林1sOC培養(yǎng)基混勻，震蕩培養(yǎng)lh，400Orpm室溫下離心smin，棄上清約800貝后余液與細(xì)菌吹打00川涂布在含卡那霉素的LB平板上。將培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱放置lh后待菌液倒置平皿，培養(yǎng)過夜。重組體的篩選

畢業(yè)論文shRNA沉默livin基因?qū)θ藧盒院诮Y(jié)果體的酶切鑒定GFP共有5117bp，BamHl位于1663bp，BbslsllRNA編碼區(qū)取代)，所得質(zhì)粒用BamHl，Bb、BamHl和Bbsl切開，而不能被Pstl切開(圖123M45

圖2.1pGPu6一GFP一hvin插入序列測(cè)序結(jié)果Figure2.1PGPU6一(;FP一livinsequeneinginsertionsequenee1工V立n1主v立n31即AtarqConsenSU3TCCCTCCATGGGACCTAA............……qaCagtgCcaagtgcCtqc圖2.2pGpU6一GFp一livin插入序列BLAsTL匕對(duì)結(jié)果Figure2.2pGpU6一GFp一livininsertionsequeneeonBLASTresults2.2顯示sllRNA的靶序列通過BLAST與Genbank記錄的人livin一cDNA序列比較，結(jié)果一細(xì)胞轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察如圖3.1

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5 記者 張e

本文編號(hào)：2751931