【摘要】：目的 構(gòu)建廣州地區(qū)尖銳濕疣復(fù)發(fā)患者病變組織分離的乳頭瘤病毒晚期基因—L1原核表達(dá)質(zhì)粒,為后續(xù)L1蛋白表達(dá)及研究復(fù)發(fā)患者感染乳頭瘤病毒L1蛋白生物學(xué)特性提供依據(jù);復(fù)發(fā)患者感染乳頭瘤病毒晚期基因測(cè)序,與原始序列比對(duì),分析其序列變片情況。 方法 擴(kuò)增復(fù)發(fā)尖銳濕疣患者病變組織中乳頭瘤病毒早期基因E6、E7之間一段保守序列,經(jīng)Rsa Ⅰ內(nèi)切酶酶切分型鑒定,選取一例感染HPV6型患者皮損,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增乳頭瘤病毒晚期基因—L1,經(jīng)酶切、純化后與經(jīng)過(guò)相同酶切的原核表達(dá)載體pQE40質(zhì)粒連接,熱沖擊入感受態(tài)大腸桿菌DH5α,經(jīng)擴(kuò)增后酶切鑒定,陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲得基因組晚期區(qū)L1序列。 結(jié)果 四例復(fù)發(fā)患者感染HPV酶切分型結(jié)果顯示,有三例臨床標(biāo)本感染HPV6型,一例感染HPV11型。這提示復(fù)發(fā)患者仍然以6/11感染為主。選取的HPV6型L1基因測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其組織來(lái)源與HPV6b型更相近。與GenBank收錄的原型相比,L1基因有7處堿基發(fā)生突變,推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列有3處發(fā)生變化。原始序列6062處的A突變?yōu)镚,其編碼的氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楸彼?6684處的核苷酸A突變?yōu)門(mén),其編碼的氨基酸由谷氨酸變?yōu)槔i氨酸;6945處的核苷酸T突變?yōu)镃,其編碼的氨基酸由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸;其余四處為:6598處的A→T,7081處的A→G,7099處的G→A,7243處的C→A,均為同義突變。 結(jié)論 成功構(gòu)建了pQE40 HPV6b L1重組質(zhì)粒;復(fù)發(fā)尖銳濕疣患者病變處HPV6 L1基因結(jié)構(gòu)有一定變異,下游序列變異程度更大。序列變異主要集中和接近在Wanderly的K3和林少洪的SR4區(qū)間即:6945位點(diǎn)、7081位點(diǎn)、7099位點(diǎn)和7243位點(diǎn)。這提示上二述區(qū)間可能是更易發(fā)生突變的區(qū)域,這些改變與病毒致病性可能存在一定關(guān)系。R1和R2易突變區(qū)間雖然較短,僅100bp左右,但本研究發(fā)現(xiàn)集中在此區(qū)間的突變都出現(xiàn)了編碼氨基酸的改變,其可能存在更加重要的生物學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R752.53
【圖文】：

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文復(fù)發(fā)性尖銳濕優(yōu)HPv6LI基因原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及序列分實(shí)驗(yàn)結(jié)果HPv型鑒別結(jié)果四例臨床標(biāo)本采用分型引物，均擴(kuò)增出了目的基因，產(chǎn)物為HVP基因E6、E7之間的保守序列，長(zhǎng)度為233bp(見(jiàn)圖)l，文獻(xiàn)報(bào)道此序列比較保守易發(fā)生突變，是理想的型別鑒別區(qū)域，模擬圖可以看出此序列經(jīng)Rasl酶切PV6型可得到144bp和96bp大小的片斷，HPVll可得到16lbp和74bp大小的(見(jiàn)圖2)。

我們對(duì)上述擴(kuò)增的CPR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，應(yīng)用RSal內(nèi)切酶酶切后，電泳發(fā)現(xiàn)有三例得到144bp和96bp大小片斷，鑒定為HVP6型;有一例得到16blp和74bp大小的片斷，鑒定為HVPn型(見(jiàn)圖3)。圖3M:100bPE6、E7之問(wèn)保守序列酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳Marker;l為HPV6型酶切結(jié)果;2為HVPll酶切結(jié)果二、HPVLl擴(kuò)增結(jié)果Ll基因是乳頭瘤病毒主要晚期基因，長(zhǎng)度約為1500Pb，是HPv分型的主要依據(jù)，也是本實(shí)驗(yàn)的目的基因。一般來(lái)講在PRC過(guò)程中，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，每400一4000bp的序列就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)堿基的誤配〔77]，這種由于Tqa酶誤配而致擴(kuò)增序列發(fā)生堿基替換是影響序列分析和分型的主要原因，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚴?500Pb

HPv6型的DNA標(biāo)本為模板，進(jìn)行PRC擴(kuò)增，然后在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳。結(jié)果示，在1500飾處有明亮的DNA條帶。未見(jiàn)雜帶。初步提示擴(kuò)增L1基因成功(見(jiàn)圖4)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號(hào)：2749431