【摘要】： 背景:皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphomas, CTCL)和急性T細胞白血病(acute T cell leukemia, ATCL)均為來源于T細胞的惡性腫瘤,其發(fā)生率和病死率均呈上升趨勢,嚴重威脅人類的健康。通常采用的治療方法是放療或化療,但這些治療措施抗腫瘤能力低并有明顯的毒副作用。長期使用非特異免疫抑制劑可使患者免疫功能嚴重受損,導(dǎo)致許多并發(fā)癥。 免疫毒素被稱為“生物導(dǎo)彈”,它是由具有靶向能力的分子(載體)和具有細胞毒性的分子組合而成的具有特異性殺傷能力的雜合分子。它通過載體的靶向作用,使其所攜帶的毒素分子到達靶細胞,發(fā)揮特異性殺傷作用。免疫毒素作為一種新型的治療手段主要有兩個特性優(yōu)于其它治療方案:其一是免疫毒素對腫瘤細胞的殺傷作用不依賴于宿主的免疫系統(tǒng),而是依賴靶向載體所攜帶的毒素起作用;其二是免疫毒素對正常細胞無殺傷作用,但能被有效地內(nèi)吞入靶細胞,具有特異性殺傷靶細胞的特性。因此,采用免疫毒素治療腫瘤具有突出的優(yōu)勢。美國FDA首次批準(zhǔn)免疫毒素藥物DAB389IL-2,也稱為地尼白介素2(denileukin diftitox)治療皮膚T細胞淋巴瘤的臨床研究,雖已進入Ⅲ期臨床試驗但仍存在一些問題。目前免疫毒素存在的主要問題是:一方面,是由于現(xiàn)有的免疫毒素多是由異源性的抗體為靶向載體,免疫原性強;另一方面,由于通常的毒素分子量較大,對組織的滲透性差。要想提高免疫毒素對靶細胞的殺傷作用,主要通過以下途徑改善:①尋找靶細胞上特異的靶點以及通過調(diào)節(jié)細胞表面靶點的表達促進免疫毒素的作用。②降低免疫毒素的抗原性,包括對載體及毒素的改造,降低它們的分子量,以及選擇人源化的載體及毒素分子。因此,免疫毒素分子的小型化和人源化是免疫毒素研究的發(fā)展趨勢。 T淋巴細胞相關(guān)的腫瘤及部分B淋巴細胞相關(guān)的腫瘤高表達CD25分子,CD25是IL-2受體(IL-2R)的α鏈,它與IL-2Rβ、IL-2Rγ鏈共同構(gòu)成高親和力的IL-2受體。在理論上可利用低濃度的人IL-2融合蛋白選擇性作用于這些淋巴瘤細胞,介導(dǎo)對瘤細胞的抑制或殺傷作用。用人IL-2作為載體具有靶向性好、免疫原性低,半衰期長、可在動物中應(yīng)用的優(yōu)勢。 植物來源的核糖體滅活蛋白(RIP)是一類作用很強的毒素,它們直接作用于核糖體,滅活其60S大亞基,具有很強的抑制蛋白質(zhì)合成的活性以及誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。Luffin家族是一類從絲瓜種子中提取的RIP,而Luffin P1是新近發(fā)現(xiàn)的Luffin家族成員,是迄今已發(fā)現(xiàn)的活性最強、分子量最小(5.2 kD)單鏈核糖體失活蛋白。由于它具有分子量小的特點,不僅便于靶向載體攜帶進入靶細胞,還有利于降低免疫毒素的免疫原性,減少毒副作用,提高療效。 維A酸類藥物具有調(diào)節(jié)上皮細胞分化與生長、維持上皮組織正常角化過程、抗腫瘤等作用,已用于多種腫瘤的誘導(dǎo)分化治療。維A酸類藥物還可以上調(diào)IL-2R的α、β鏈的表達,通過調(diào)節(jié)細胞表面靶點的表達而促進免疫毒素的作用。在初步臨床試驗中免疫毒素與維A酸聯(lián)合應(yīng)用治療CTCL,使病情緩解率提高,并且沒有出現(xiàn)毒副作用的增加。 基于以上理由,我們設(shè)想利用基因工程方法構(gòu)建一種新的免疫毒素hIL-2-Luffin P1,使其hIL-2片段特異性識別表達IL-2受體的腫瘤靶細胞,從而把毒素分子帶入靶細胞內(nèi),發(fā)揮抗腫瘤的作用。另一方面,希望憑借芳維A酸乙酯能上調(diào)IL-2受體的表達而與上述免疫毒素聯(lián)合使用,以提高免疫毒素的靶向結(jié)合能力,增強hIL-2-Luffin P1對靶細胞的殺傷作用。 目的:構(gòu)建、表達及純化能特異性殺傷皮膚T細胞淋巴瘤和急性T細胞白血病的重組免疫毒素hIL-2-Luffin P1及作為對照的毒素分子蛋白Luffin P1。觀察hIL2-Luffin P1、芳維A酸乙酯、hIL2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯、Luffin P1對Hut-78細胞和Jurkat細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。 方法:(1)應(yīng)用PCR擴增目的基因(hIL2-Luffin P1、Luffin P1)片段,然后將它們分別克隆到表達載體pET32a(+)中,并對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定及基因測序。測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達菌BL21中,進行誘導(dǎo)表達。分別用鼠抗人的His單克隆抗體、兔抗人IL-2多克隆抗體進行Western blot鑒定。蛋白大量誘導(dǎo)表達后經(jīng)過蛋白的純化、復(fù)性、脫鹽、腸激酶酶切、再純化,最后用兔抗人IL-2多克隆抗體進行Western blotting鑒定目的蛋白hIL2-Luffin P1中IL-2成分的表達。(2)應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測Hut-78細胞、Jurkat細胞表面CD25分子的表達。然后分為hIL-2-Luffin P1組、芳維A酸乙酯組、hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯組、Luffin P1組,分別于不同濃度和不同時相點分別作用于Hut-78細胞和Jurkat細胞。應(yīng)用MTT法觀察細胞的生長抑制率,流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡及細胞周期。 結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了帶有KDEL結(jié)構(gòu)的原核表達質(zhì)粒PET32a(+)-hIL-2-Luffin P1和PET32a(+)-Luffin P1。(2)經(jīng)過蛋白的誘導(dǎo)表達,超聲破菌后,分離結(jié)果顯示,hIL-2-Luffin P1蛋白以包涵體的形式存在,而Luffin P1蛋白為部分可溶性表達。經(jīng)過蛋白的純化、腸激酶酶切及鑒定,最后得到了具有較好活性的hIL2-Luffin P1蛋白及作為對照的毒素分子蛋白Luffin P1(。3)免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示:IL-2受體α鏈(CD25)在Hut-78細胞和Jurkat細胞表面高表達,其表達陽性細胞比例分別為79.32%和54.47%。(4)MTT結(jié)果顯示:hIL-2-Luffin P1組、芳維A酸乙酯組、hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯組均可抑制Hut-78細胞和Jurkat細胞增殖,且呈劑量和時間依賴性效應(yīng)。其中聯(lián)合組的作用明顯強于單一用藥組,而Luffin P1組對兩種細胞增殖均沒有明顯的抑制作用。hIL-2-Luffin P1組和hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯組對Hut-78細胞的抑制率明顯高于Jurkat細胞。hIL-2-Luffin P1對Hut-78細胞和Jurkat細胞的IC50分別為27.361μg/ml和39.634μg/ml。芳維A酸乙酯組對Hut-78細胞和Jurkat細胞均有明顯的抑制作用,但對兩種細胞抑制率的差異不明顯。(5)Annexin V/PI雙標(biāo)法流式細胞術(shù)檢測顯示,hIL-2-Luffin P1、芳維A酸乙酯、hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯均可以誘導(dǎo)Hut-78細胞和Jurkat細胞發(fā)生早期凋亡,其中聯(lián)合組的作用明顯強于單一用藥組。而Luffin P1無明顯誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。(6)流試細胞術(shù)檢測細胞周期顯示:hIL-2-Luffin P1組及hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯組均可使Hut-78和Jurkat細胞停滯在G1期,提示hIL-2-Luffin P1或hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯均能阻止兩種細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化。 結(jié)論:用基因工程方法成功構(gòu)建、表達、純化了免疫毒素hIL-2-Luffin P1蛋白及毒素分子Luffin P1蛋白。hIL-2-Luffin P1能夠抑制Hut-78細胞和Jurkat細胞增殖,促進Hut-78細胞和Jurkat細胞凋亡,使細胞周期停滯在G1期,并且其抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用呈劑量和時間依賴性效應(yīng)。而毒素Luffin P1蛋白對上述兩種細胞的增殖、凋亡及細胞周期均無明顯作用。這提示免疫毒素hIL-2-Luffin P1能夠針對表達IL-2R的Hut-78細胞和Jurkat細胞產(chǎn)生定向殺傷作用。hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯也能抑制Hut-78細胞和Jurkat細胞的增殖,促進Hut-78細胞和Jurkat細胞凋亡,并可使細胞周期停滯在G1期,二者合用時抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用也呈劑量和時間依賴性效應(yīng)。hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯的作用明顯比單用hIL-2-Luffin P1或單用芳維A酸乙酯時強。由此提示免疫毒素hIL-2-Luffin P1聯(lián)合芳維A酸乙酯對Hut-78細胞和Jurkat細胞具有協(xié)同作用。本課題的研究結(jié)果對皮膚T細胞淋巴瘤和急性T細胞白血病的治療具有探索、啟示和借鑒意義。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖 1-3. 重組質(zhì)粒 pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1 的酶切凝膠電泳圖注：1. 5 Marker；2. 3 和 4 酶切后的載體 DNA 片段與目的基因 DNA 片段（四）hIL-2-Luffin P1 融合基因序列測定為進一步鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒中 hIL-2-Luffin P1 融合基因是否符合設(shè)計要求酶切鑒定正確的質(zhì)粒，進行 DNA 測序，結(jié)果表明 hIL-2-Luffin P1 融合基要求，閱讀框架正確，無移碼和錯碼，如圖所示(圖 1-4)。2322b590bp1000bp2000bp750bp500bp100bp

1 2 3 4 5 6 7圖 1-5. PCR 擴增目的基因片段 Luffin P1 凝膠電注：1. Marker；2. 3. 4. 5. 6 目的基因片段 Luffi pET32a(+)-Luffin P1 的酶切鑒定pET32a(+)-Luffin P1，再通過 NcoI、XhoI 雙片段，基因片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（見1 2 3 4 5 600bp00bp00bp50bp

圖 1-7. LuffinP1 目的基因 DNA 測序圖三、hIL-2-Luffin P1 的誘導(dǎo)表達及鑒定用酶切、測序鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主菌 BL21 中，帶有重2a(+)-hIL-2-Luffin P1 的表達菌 BL21，在 37℃分別于不同的 IPTG 終濃度和進行誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 蛋白電泳。結(jié)果顯示：在 35 kD 與出現(xiàn)陽性條帶，與預(yù)期的目的蛋白分子量大�。�39.66 kD）相符，而作為導(dǎo)組，目的蛋白條帶較弱。其中以 1 mmol/L IPTG 終濃度，誘導(dǎo) 3 h，蛋白(見圖 1-8)。將誘導(dǎo) 3 h 組與未誘導(dǎo)組的蛋白樣品，用鼠抗 His 標(biāo)簽單克隆ern blot 鑒定。結(jié)果顯示，誘導(dǎo) 3 h 組蛋白條帶顏色較深，而未誘導(dǎo)組蛋白弱(見圖 1-9)。因為融合蛋白 hIL-2-Luffin P1 中有 IL-2 成分，對融合-Luffin P1 用兔抗人 IL-2 單克隆抗體進行 Western blot 鑒定，證明所表達中有 hIL-2 的顯著表達(見圖 1-10)。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李秋榮,馬健,汪灝,黎介壽;T細胞膜脂肪微區(qū)域與白細胞介素-2α受體[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2004年05期

本文編號：2744452