【摘要】：目的:初步探討雷帕霉素在不同濃度和不同孵育時間下,對人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)及其分子機(jī)制。方法:不同濃度雷帕霉素處理HaCaT細(xì)胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測雷帕霉素對細(xì)胞活力的影響,并提取蛋白進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測LC3-Ⅱ表達(dá)水平,作為自噬的檢測方法;通過透射電鏡分析自噬體形成,確認(rèn)雷帕霉素對自噬的誘導(dǎo)效果。檢測自噬調(diào)控上游關(guān)鍵元件哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表達(dá)及其se~(2481)和ser~(2448)磷酸化產(chǎn)物水平,分析mTOR活性;并分析自噬調(diào)控下游的另一關(guān)鍵基因Atg7的表達(dá),初步分析雷帕霉素誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的分子機(jī)制。結(jié)果:不同濃度雷帕霉素處理4 h,對HaCaT細(xì)胞的活力沒有顯著的影響。高劑量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在處理12 h后對HaCaT細(xì)胞的活力產(chǎn)生毒性效應(yīng)。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào),而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有誘導(dǎo)效應(yīng)。相較于其他濃度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)效應(yīng)最為顯著,并且在藥物孵育4h時超微結(jié)構(gòu)水平誘導(dǎo)產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)大量自噬體形成。1~50nmol/L濃度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞mTOR ser~(2481)和mTOR ser~(2448)磷酸化產(chǎn)物水平降低:然而Atg7表達(dá)不能觀測到顯著的差異。結(jié)論:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有顯著的誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬效應(yīng)。HaCaT細(xì)胞mTOR分子對雷帕霉素處理敏感,可被其誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白活化抑制效應(yīng)。這種mTOR信號抑制可能參與了雷帕霉素對HaCaT細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)效應(yīng),但Atg7沒有參與這種調(diào)控效應(yīng)。
【圖文】：

70 臨床皮膚科雜志2014年43卷第5期JClinDermatol,May2014,Vol.43,No.5：二…7-i—-i289 —mTOR S+p2448) i289?_mTOR mKm-?:SB78Atg-7 fSm f16 LC3-I ffi,二Q\0？14 —?—| m451 ra,"n 理HP?>_、取1：空白對照,2:DMSO，3:lnmol/L雷帕霉素， A、B:細(xì)胞全景圖(xl500)，C、D:左側(cè)細(xì)胞的4:5nmol/L雷帕霉素,5：10nmol/L雷帕霉素， 局部放大圖，部分囊泡內(nèi)可見皺縮損傷的線6：20nmol/L雷帕霉素,7：50nmol/L雷帕霉素 粒體結(jié)構(gòu)(x6000)圖1雷帕霉素孵育HaCaT細(xì)胞4h的 圖350nmol/L雷帕霉素處理HaCaT蛋白表達(dá)和磷酸化分析 細(xì)胞4h后自噬體形成電鏡圖像等[15]的研究表明，雷帕霉素可以誘導(dǎo)WRN缺陷的人ku1234567 成纖維細(xì)胞自噬，并且可以減低DNA損傷聚集和促2891?一nS^mT0R 進(jìn)細(xì)胞生長。此外,Xiao等M利用深二度燒傷模型大鼠==^,mR 研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以通過誘導(dǎo)自噬延緩組織損傷289L__ 1^24487 及促進(jìn)表皮再生修復(fù)。因此,雷帕霉素在皮膚的病理289| |mT0R 學(xué)和生理學(xué)中的研究價值值得關(guān)注。]—=====^ 隨著在生命科學(xué)領(lǐng)域中自噬研究的不斷深入，作78Atg-7 為人類最大器官的重要構(gòu)成——角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的 生物學(xué)意義得到了很多學(xué)者的關(guān)注。例如，自噬參與角15 質(zhì)形成細(xì)胞分化ii7],某些藥物或生物學(xué)活性物質(zhì)可以‘ 誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞自噬…、然而，雷帕霉素對角質(zhì)形45p_actin 成細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)及其分子機(jī)制目前仍然缺乏研,‘,j+|)g,丨、階),~ ：.,^ 究資料。0此,我們設(shè)計(jì)并實(shí)施了本項(xiàng)研究。使用不同1:空白對照，2:DMSO，3:1nmol/L雷帕霉素， 、Nr^N:^山二系豐.^ A?,

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