【摘要】： 目的 1．探討在正常及炎癥刺激后，結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)mRNA在小鼠表皮、真皮、表真皮組織中的表達(dá)情況，并采用原位雜交方法進(jìn)行定位觀察，以確定Hp mRNA在皮膚中的表達(dá)位置及其與炎癥的關(guān)系。 2．在mRNA水平探討正常人皮膚中Hp的表達(dá)，以進(jìn)一步觀察Hp mRNA在皮膚中表達(dá)的確切位置及其在不同部位皮膚中的表達(dá)差異；在蛋白質(zhì)水平上研究Hp在正常人皮膚中的表達(dá)情況。 3．探討Hp mRNA在銀屑病患者皮損及皮損周邊外觀正常皮膚、扁平苔蘚、紅皮病、脂溢性角化病、尋常疣、基底細(xì)胞上皮瘤、鱗癌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者皮損及曝光部位正常皮膚、天皰瘡、大皰性類天皰瘡患者皮損中的表達(dá)，進(jìn)一步確定Hp mRNA在皮膚中的表達(dá)位置及在不同皮膚病中表達(dá)的差異；并在蛋白質(zhì)水平觀察Hp在上述皮損中的表達(dá)情況。 材料和方法 1．標(biāo)本收集 1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL／6小鼠20只，分為生理鹽水組和細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激組，每組10只。均為雌性，2～4月齡。分別獲取表皮、真皮和表真皮組織。 1．2正常人皮膚 30例正常成人皮膚來自外科手術(shù)患者，男19例，女11例。其中頭皮2例，面部6例，軀干部13例，四肢9例。取材部位無腫瘤及炎癥性皮膚病損害，所取皮膚組織均去除皮下脂肪組織。 1．3皮膚病患者皮損 尋常型銀屑病22例，其中進(jìn)展期14例，穩(wěn)定期8例，同時(shí)取16例患者的皮損周邊外觀正常皮膚；扁平苔蘚16例；紅皮病8例(2例由蕈樣肉芽腫誘發(fā)，3例由銀屑病誘發(fā)，3例由濕疹誘發(fā))；脂溢性角化病15例；尋常疣10例；基底細(xì)胞上皮瘤10例；鱗癌10例；系統(tǒng)性紅斑狼瘡12例，同時(shí)取10例患者的曝光部位正常皮膚；天皰瘡10例，其中尋常型7例，紅斑型3例；大 瘡性類天瘡瘡10例。以上患者均經(jīng)臨床、組織病理及免疫病理學(xué)等檢查確 定診斷。 2．實(shí)驗(yàn)方法 2．l半定量RT－PCR 2．豆．l小鼠組織總RNA的提取 所取組織制成勻漿后，用異硫氰酸狐－酚－氯仿一步法提取總RNA。 2．1．2總RNA濃度、純度和完整性測(cè)定 用紫外分光光度儀測(cè)定RNA在260urn和280run處的光密度值，以確 定 RNA的濃度和純度。用 1．5％甲醛瓊脂糖凝膠電泳證實(shí) RNA的完整 性。 2．1．3對(duì)小鼠組織所提取的RNA進(jìn)行RT—PCR檢測(cè) 分別按照要求制備反應(yīng)體系并在特定條件下完成反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)， 每一個(gè)標(biāo)本均分別用HP和內(nèi)對(duì)照p－actin引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HP特 異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為475hP，P－actin特異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為54O hP。 2．2原位雜交法檢測(cè) 2．2．l所有小鼠表真皮、正常人皮膚組織和皮膚病患者皮損組織均按 照要求在－25℃恒冷切片機(jī)上制備12pm厚的切片。 LL二采用小鼠及人Hp原位雜交檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)小鼠及 人 Hp的 CDNA探針序列如下：5’－AGTGC TCCAC ATAGC CA’I’GT GCAAT CTCGG—3’，5’一 CCTGC CAGGG AAAGC TGCCT ITGGC ATCCA－3’，5’ 一 CATAC CAGGT GTCCT CCTCC AGGTC GTGAA—3’。 2．2．3對(duì)照的設(shè)立：陽(yáng)性對(duì)照為小鼠肝組織；陰性對(duì)照為同一標(biāo)本的切 片省略生物素化鼠抗地高辛或省略探針。 2．3免疫組織化學(xué)［鏈霉卵白素標(biāo)記的親合素、生物素（LAB－SA） 法廠染色 對(duì)所有正常人皮膚組織和皮膚病患者皮損組織均用抗－地單克隆抗 體、生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG及辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素進(jìn)行檢測(cè)。 2．4免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè) 對(duì)所有正常人皮膚組織和皮膚病患者皮損組織均用抗－Hp單克隆抗 體、羅丹明標(biāo)記的羊抗鼠哪和FITC標(biāo)記的CDla單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。 3．結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) ·2· 3．IPCR產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物在＊5％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。電 泳結(jié)果采用 Flo毗hem V 2．0凝膠成像分析軟件（AInerica）分析，記錄每條 DNA擴(kuò)增帶的灰度值，將每一個(gè)目的DNA擴(kuò)增片段的灰度值與相應(yīng)的內(nèi) 對(duì)照p－achn擴(kuò)增片段的灰度值的比值（e／c）作為每一個(gè)目的基因InRNA 的半定量指標(biāo)。 3．2原位雜交結(jié)果 細(xì)胞漿染成桔紅色為陽(yáng)性，結(jié)果用 Meta Morph Im哈ng System軟件處 理，按圖象灰度結(jié)果分為五個(gè)等級(jí)：無染色，灰度值不少于 130，為陰性 （－入輕微染色，灰度值在125－130之間，為弱陽(yáng)性（。＊染色較淺，灰度 值在115刁 之間，為陽(yáng)性（＋＊染色較深，灰度值在105＊ 之間，為較 強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋八染色深，灰度值不大于105，為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋八 3．3免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 每個(gè)標(biāo)本至少對(duì)三張連續(xù)切片進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽(yáng)性樹突狀細(xì)胞以同時(shí)見到 胞體和樹突來確定。陽(yáng)性樹突狀細(xì)胞的密度采用：線性密度＝陽(yáng)性細(xì)胞剃 nun（表皮長(zhǎng)度）和（或）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／rum＼表皮面積＊ 400倍顯微鏡下隨機(jī) 選取20個(gè)連續(xù)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)）來表示。 3．4免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果 呈現(xiàn)樹突狀結(jié)構(gòu)并發(fā)出紅色熒光為HP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞；呈現(xiàn)樹突狀 結(jié)構(gòu)并發(fā)出亮綠色熒光為CDla丫 朗格漢斯細(xì)胞。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 4．l兩組小鼠表皮和表真皮組織
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R751

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李萍,張亞芹,王巖,王合,王雅坤,陳洪鐸;結(jié)合珠蛋白在正常人皮膚中的定位表達(dá)[J];中華皮膚科雜志;2003年04期

本文編號(hào)：2728118