【摘要】：研究背景及目的:皮膚老化是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,它既包括隨著時(shí)間或者遺傳因素發(fā)生的內(nèi)源性老化,也包含由環(huán)境因素如紫外線輻射等引起的光老化。由于紫外線中至少95%以上的長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A,UVA)可到達(dá)地面,并且能深入地穿透表皮和真皮,長(zhǎng)期紫外線輻射可導(dǎo)致皮膚粗糙、細(xì)紋、色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張、真皮變薄、深皺紋等,甚至皮膚腫瘤形成。UVA輻射是引起皮膚光損傷和老化的最重要的環(huán)境因素之一。目前預(yù)防及治療皮膚老化方式較多,包括防曬霜、護(hù)膚品、激光、注射、手術(shù),光動(dòng)力治療等等。光動(dòng)力療法(photodynamic therapy,PDT)是指在氧氣及光敏劑的參與下,通過特定光源照射皮損部位產(chǎn)生活性氧等物質(zhì),發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而達(dá)到治療目的。光動(dòng)力效應(yīng)有兩種機(jī)制,包括Ⅰ型和Ⅱ型反應(yīng)。通過氫原子或電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生除單線態(tài)氧以外的其它自由基或自由基離子,這些自由基再和生物分子以及氧氣分子反應(yīng)生成氧化產(chǎn)物,稱為Ⅰ型反應(yīng)。而通過能量轉(zhuǎn)移主要產(chǎn)生高活性的氧化劑-單線態(tài)氧(~1O_2),~1O_2迅速與鄰近的生物分子反應(yīng)并造成損傷,這一過程稱為Ⅱ型反應(yīng);兩型反應(yīng)可同時(shí)出現(xiàn),最終達(dá)到損傷、破壞組織或細(xì)胞的作用。目前在皮膚疾病中,光動(dòng)力療法已得到廣泛應(yīng)用,治療包括日光性角化病、尖銳濕疣、痤瘡、鮑溫病等疾病。近年來,低劑量光動(dòng)力的嫩膚作用也逐漸被人們認(rèn)識(shí),成為一種新型無創(chuàng)、安全、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)的光老化治療方式。較多的臨床研究發(fā)現(xiàn),高劑量光動(dòng)力療法通過在靶組織內(nèi)產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS),引發(fā)細(xì)胞凋亡從而達(dá)到殺滅腫瘤及微生物的作用;而低劑量光動(dòng)力治療光老化皮膚后其質(zhì)地、膚色明顯改善,其中作用機(jī)制尚不十分清晰,可能是產(chǎn)生少量ROS引起細(xì)胞損傷后修復(fù),刺激成纖維細(xì)胞增殖,加速皮膚愈合,引起真皮膠原蛋白的增加和彈性纖維變性的減少,從而達(dá)到真皮重塑,膠原新生的效果。當(dāng)紫外線長(zhǎng)期輻射造成體內(nèi)過多的活性氧累積,超出體內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激的抵御功能,產(chǎn)生光損傷或者光老化表現(xiàn)。核因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,與下游的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合后形成Nrf2/ARE信號(hào)通路,該通路在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用,控制一系列抗氧化和解毒酶,對(duì)光老化有保護(hù)和治療作用。本文通過建立體外光老化細(xì)胞模型,探討低劑量ALA(5-aminolevulinic acid)-PDT是否能夠激活光老化細(xì)胞中Nrf2,產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激反應(yīng),達(dá)到治療光老化的作用并研究其中的機(jī)制。方法:1.按照我科既往方法分離培養(yǎng)原代人包皮成纖維細(xì)胞;2.光老化細(xì)胞模型:以長(zhǎng)波紫外線光源照射人成纖維細(xì)胞,制作人成纖維細(xì)胞光老化模型;3.通過實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀(Real-Time Cell Analyzer,RTCA)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;4.采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase SA-β-Gal)試劑盒檢測(cè)UVA照射成纖維細(xì)胞后衰老細(xì)胞比例;5.倒置顯微鏡觀察紫外線照射成纖維細(xì)胞后形態(tài)變化;6.采用SOD試劑盒檢測(cè)ALA-PDT處理光老化成纖維細(xì)胞后細(xì)胞總SOD水平;7.核漿蛋白分離試劑盒檢測(cè)不同劑量光動(dòng)力處理后細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白水平變化;8.構(gòu)建siNrf2腺病毒載體,擴(kuò)增腺病毒并感染光老化的成纖維細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察感染效率,通過定量聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及免疫印跡法(Western blot,WB)檢測(cè)Nrf2在mRNA和蛋白水平的沉默效率;9.用免疫印跡法分析ALA-PDT處理后的成纖維細(xì)胞中Nrf2、TGF-β1、HO-1、COL1、COL3、ERK、p-ERK和MMP-9蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1.成功制備光老化細(xì)胞模型:隨著UVA劑量增大,顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)變得寬大扁平,出現(xiàn)脫顆�，F(xiàn)象,甚至凋亡:實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞增殖減慢,當(dāng)UVA劑量為10J/cm~2時(shí),細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間增殖后出現(xiàn)停滯狀態(tài),當(dāng)UVA劑量為20 J/cm~2細(xì)胞增殖受到明顯抑制;SA-β半乳糖苷酶檢測(cè)到衰老細(xì)胞陽(yáng)性率與UVA呈劑量依賴關(guān)系。2.ALA-PDT處理光老化成纖維細(xì)胞后,Nrf2和相關(guān)因子表達(dá)的變化(1)細(xì)胞中總SOD活性均有所增高,但在低劑量(0.1mM ALA,21J/cm~2紅光)光動(dòng)力組升高最為明顯;(2)核漿蛋白分離實(shí)驗(yàn)提示,低劑量(0.1mM ALA,21J/cm~2紅光)光動(dòng)力處理光老化細(xì)胞組中,Nrf2在細(xì)胞核表達(dá)明顯增高;(3)WB結(jié)果顯示,低劑量(0.1mM ALA,21J/cm~2紅光)光動(dòng)力組中p-ERK、Nrf2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-β1)、血紅素氧合酶-1(HO-1)及Ⅰ、III型膠原蛋白(COL1、COL3)表達(dá)上調(diào),基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)有所下降;當(dāng)腺病毒(Ad-siNrf2)感染成纖維細(xì)胞后,TGF-β1、HO-1表達(dá)下調(diào),Ⅰ、III型膠原蛋白合成減少,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9表達(dá)增高。結(jié)論:1.采用UVA劑量為10J/cm~2,照射成纖維細(xì)胞,連續(xù)5天,可成功制備成纖維細(xì)胞光老化模型;2.在光動(dòng)力療法治療光老化成纖維細(xì)胞中,低劑量光動(dòng)力通過激活Nrf2相關(guān)的途徑增強(qiáng)抗氧化能力,促進(jìn)真皮膠原蛋白生成,減少其降解;敲低Nrf2表達(dá)后,細(xì)胞合成膠原減少,抗氧化水平下降,提示轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在抗氧化、促進(jìn)膠原增生中起著重要調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R758.1
【圖文】：

圖 2-1 UVA 照射對(duì)成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響. Scale bar = 200 μm2.2.2 紫外線照射后 SA-β 半乳糖苷酶比率不同劑量 UVA 連續(xù)照射成纖維細(xì)胞 5 天后，隨著 UVA 劑量增大，藍(lán)染細(xì)胞逐漸增多，呈劑量依賴。實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照組衰老成纖維細(xì)胞陽(yáng)性率為 17.68%，UVA 劑量為5、10、20J/cm2時(shí)陽(yáng)性率分別為 33.09%、79.11%、73.25%，與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.005）。但當(dāng) UVA 劑量達(dá) 20J/cm2時(shí)，部分細(xì)胞收縮成團(tuán)，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，剩余細(xì)胞染色呈藍(lán)染。（圖 2-2）

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文.2.3 紫外線影響成纖維細(xì)胞增殖過RTCA 細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)發(fā)現(xiàn) 0-48h所有細(xì)胞增殖均呈上升趨勢(shì)，無明 時(shí)，每組細(xì)胞 Cell Index(CI)分別為 2.89±0.13，2.75±0.13，2.04±0.11，1.90量為 0 J/cm2和 5 J/cm2兩組間細(xì)胞增殖仍呈上升趨勢(shì)，然而 UVA 劑量為J/cm2兩組間細(xì)胞增殖開始出現(xiàn)停滯；在 144h 時(shí)，每組細(xì)胞 Cell Index(CI).48，6.14±0.39，1.74±1.071，0.015±0.045,隨著時(shí)間延長(zhǎng),UVA 劑量增大,細(xì)響，與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；當(dāng) UVA 劑量為 20 J/cm2時(shí)細(xì)胞抑制，增殖曲線負(fù)向影響,且結(jié)合倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞收縮成團(tuán)，部浮于培養(yǎng)基中。（圖 2-3）

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本文編號(hào)：2723413