【摘要】：銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其病因復(fù)雜，各種內(nèi)外因素共同參與其發(fā)病機(jī)制。銀屑病患者具有明顯的免疫學(xué)異常，多種細(xì)胞因子作為主要的效應(yīng)分子參與銀屑病的病理過程。 IL-8是銀屑病患者體內(nèi)一種主要的異常表達(dá)的細(xì)胞因子。角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等是銀屑病患者體內(nèi)主要的IL-8來源，而IL-8受體則廣泛地分布于銀屑病患者的角質(zhì)形成細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞。在銀屑病的病理過程中，IL-8既作為啟動(dòng)分子趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等向皮膚移行和浸潤，促進(jìn)其他細(xì)胞因子的分泌，又作為效應(yīng)分子直接刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，并促進(jìn)真皮淺層血管的增生。因此通過抗體阻斷IL-8與受體之間的作用有可能對(duì)銀屑病具有治療效果。 噬菌體抗體庫技術(shù)通過將全套抗體基因展示在噬菌體表面，為此便可以方便地利用不同抗原篩選相應(yīng)的抗體，這不僅是一種制備人源性抗體的有效方法，而且大容量、具有良好多樣性的抗體庫，對(duì)獲得高親和力的抗體以及在對(duì)抗體性能進(jìn)行改造方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。噬菌體抗體庫技術(shù)已經(jīng)成為抗體工程領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一。以噬菌體抗體庫技術(shù)為 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 技術(shù)平臺(tái)制備人源性抗IL一8抗體有可能為銀屑病的治療帶來新的希望。 IL一8一His融合蛋白原核表達(dá)載體PRSET-IL一8經(jīng)常規(guī)氯化鈣法轉(zhuǎn)化 BLZI(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)菌 生長至半對(duì)數(shù)期時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。細(xì)菌沉淀經(jīng)超聲裂菌后過 0.45 pm濾膜，取上清對(duì)PBS透析過夜。透析后的上清以His抗體免疫親 和層析柱純化，純化后的蛋白經(jīng)PBS透析后以SDS一PAGE電泳鑒定純化 效果。結(jié)果表明，在30℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)的情況下，IL一8一His融合蛋白在 大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)于細(xì)菌周質(zhì)腔中，，經(jīng)SDS一PAGE電泳鑒定表 明，純化后的蛋白在分子量約11 000大小處呈單一條帶。經(jīng)分光光度計(jì) 粗定量測得IL一8一His融合蛋白的濃度約為1.59幾。 純化后的IL一8一HIS融合蛋白以包被緩沖液稀釋后固相化至抗原管， 以BSA/PBS封閉后加入噬菌體抗體庫孵育，用含O，05%吐溫的PBS洗滌 后加入半對(duì)數(shù)生長期的XL-Blue細(xì)菌。感染巧min后取適量鋪于含氨節(jié) 青霉素的LB平板測定滴度，其余菌液擴(kuò)大培養(yǎng)。在氨節(jié)青霉素和卡那霉 素的壓力選擇下，加入輔助噬菌體VCSM誘導(dǎo)噬菌體抗體擴(kuò)增。次日濃 縮噬菌體抗體即次級(jí)庫，用于下一輪篩選。共進(jìn)行3輪篩選，每輪篩選 均測定次級(jí)庫的滴度，并計(jì)算噬菌體抗體的投入產(chǎn)出比(回收率)作為特異 性噬菌體抗體富集的指標(biāo)。在第3輪篩選后，從含氨節(jié)青霉素的 LB平板 上挑單克隆于SB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，于半對(duì)數(shù)生長期加入輔助噬菌體 VCSM誘導(dǎo)噬菌體抗體表達(dá)，離心收集上清即為噬菌體抗體上清。以 lL一8一His融合蛋白包被ELISA板，依次加入待測噬菌體抗體上清及H即- 羊抗M13抗體，最后以O(shè)PD底物顯色。顯色陽性的克隆再以IL一8一His 融合蛋白、人IgG、表皮角蛋白、BSA和His蛋白為抗原分別包被ELIsA 板，鑒定抗原、抗體反應(yīng)的特異性。經(jīng)過3輪篩選，噬菌體抗體的回收 率得到約300倍的富集。最后一輪篩選后挑取的60個(gè)單菌落制備噬菌體 抗體，經(jīng)ELISA檢測第2株和第23株克隆與IL一8一His融合蛋白具有結(jié)合 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 活性，而與人IgG、表皮角蛋白等無關(guān)蛋白均無結(jié)合活性，表明所獲得的 噬菌體抗體具有較高的特異性。測序結(jié)果表明，克隆2和克隆23的VH 基因均屬于人免疫球蛋白VH3亞群，V入基因則分別屬于V入DPLS和 V入DPLZ亞群。 IL一8作為與銀屑病密切相關(guān)的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是治療銀屑病的靶 點(diǎn)之一，然而目前的臨床資料卻顯示了兩種抗IL一8抗體迥然不同的治療 效果，因此抗IL一8抗體對(duì)銀屑病的治療作用尚無法評(píng)價(jià)。改變抗IL一8抗 體的應(yīng)用方式，開發(fā)穿透性更強(qiáng)的小分子抗體、特異性更強(qiáng)的抗IL一8/抗 角蛋白雙特異性抗體，對(duì)抗體進(jìn)行人源化和提高抗體的親和力等有可能 提高抗IL一8抗體治療銀屑病的療效。本研究通過噬菌體抗體庫技術(shù)制備 了抗IL一8單鏈抗體，有望通過直接應(yīng)用或進(jìn)一步構(gòu)建抗IL一8/抗角蛋白雙 特異性雙鏈抗體，從而達(dá)到治療銀屑病的目的。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 晉紅中,王家璧,何志新,謝勇;IL-8單克隆抗體乳膏治療尋常型銀屑病隨機(jī)雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2001年01期

2 鄭淑云,張巖,商剛,趙育瑩;銀屑病患者白介素8的觀察[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1997年04期

3 王妍,張興義;幾種柱層析的特點(diǎn)和在純化工藝中的選擇[J];中國生物制品學(xué)雜志;1999年03期

本文編號(hào)：2708076