【摘要】： 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是導(dǎo)致人類淋病(gonorrhea)的病原菌。人是淋病奈瑟菌的唯一宿主,經(jīng)性行為傳播,多侵襲泌尿生殖道黏膜,主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎等;在女性主要以隱形感染為主,常因不能及時醫(yī)治而最終導(dǎo)致盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、甚至導(dǎo)致不孕癥。淋病在全球范圍內(nèi)流行廣泛,是發(fā)病率最高的性傳播疾病(STD)之一。近年來隨著淋病奈瑟菌耐藥性的日益增強(qiáng),淋病的治療變得越發(fā)困難,深入研究淋病奈瑟菌的生物學(xué)特性及其與宿主間的相互作用機(jī)制,研制有效的淋病疫苗和治療藥物成為淋病防治工作的重中之重。但是缺乏有效的動物模型卻阻礙著淋病的研究進(jìn)程。 研究證實(shí),黏附定植于黏膜組織是淋病奈瑟菌感染的第一步,也是關(guān)鍵性的一步。淋病奈瑟菌的黏附定植是一個非常復(fù)雜的過程,涉及淋病奈瑟菌多種黏附因子和機(jī)體細(xì)胞上相應(yīng)受體間的相互作用,其中Opa蛋白與其受體間的結(jié)合使得淋病奈瑟菌最終得以實(shí)現(xiàn)感染。Opa蛋白是淋病奈瑟菌編碼的一組易變異的外膜蛋白,共有11～12種:OpaA、B、C……K(L)。絕大多數(shù)種類的Opa蛋白可以人癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1 (human carcinoembryonic antigen related cellular adhesion molecule 1, hCEACAM1)為受體,95%以上的淋病奈瑟菌臨床分離株均可與hCEACAM1結(jié)合。Opa蛋白與hCEACAM1的結(jié)合使得淋病奈瑟菌的黏附作用更加緊密,淋病奈瑟菌進(jìn)而穿過上皮細(xì)胞,進(jìn)入黏膜下層產(chǎn)生炎癥。直接表達(dá)于泌尿生殖道黏膜上皮細(xì)胞頂面的hCEACAM1提供了淋病奈瑟菌感染的穿入點(diǎn)或侵入組織的一扇門,在淋病奈瑟菌的感染過程中具有重要意義。細(xì)胞模型研究證明,表達(dá)hCEACAM1的動物細(xì)胞均可以接受淋病奈瑟菌的粘附和侵入,提示hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠可成為淋病研究的良好動物模型。 本課題利用前期構(gòu)建的hCEACAM1真核表達(dá)載體,通過顯微注射法制備了hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠,并初步研究了其在淋病奈瑟菌感染動物模型中的應(yīng)用價值。研究主要分為以下幾個部分: 一、顯微注射法制備hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠 在本實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上,將表達(dá)hCEACAM1的基因構(gòu)件通過顯微注射的方法注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,得到hCEACAM1轉(zhuǎn)基因F0代小鼠共22只。通過PCR技術(shù)反復(fù)篩選并將PCR產(chǎn)物測序分析,得到4只(50#、53#、54#、59#)PCR陽性的hCEACAM1 F0代轉(zhuǎn)基因小鼠。初篩后的4只PCR陽性小鼠分別與同品系正常小鼠交配繁殖,得到的F1代小鼠通過PCR方法反復(fù)篩選,對陽性小鼠進(jìn)行同組間的兄妹交配,得到F2、F3代轉(zhuǎn)基因小鼠。F2、F3代轉(zhuǎn)基因小鼠同樣通過PCR的方法進(jìn)行反復(fù)篩選,得到的陽性小鼠繼續(xù)采用同組的兄妹交配方法進(jìn)行繁殖,以期能得到純合子的hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠。 二、hCEACAM1多克隆抗體的制備 為了進(jìn)一步分析hCEACAM1蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況,通過分析,找出hCEACAM1蛋白胞外區(qū)中抗原特異性最強(qiáng)的一段表位,采用PCR方法擴(kuò)增出其編碼序列,并將其連進(jìn)pGEX-4T-1載體中,進(jìn)行原核表達(dá)。以表達(dá)的GST-hCEACAM1融合蛋白為抗原,應(yīng)用切膠免疫的方法制備了抗hCEACAM1的多抗血清。通過與商品化的hCEACAM1單抗比較,證實(shí)了所制備的抗hCEACAM1多抗血清能特異性識別hCEACAM1蛋白。 三、hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)目的基因的表達(dá) 應(yīng)用制備的hCEACAM1多抗血清對4只F0代PCR陽性轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了體內(nèi)hCEACAM1蛋白表達(dá)情況的分析。通過Western-blot方法證實(shí),在4只F0代PCR陽性小鼠中,只有53#F0代小鼠及其后代體內(nèi)各組織器官表達(dá)了hCEACAM1蛋白,同時應(yīng)用免疫熒光的方法證實(shí)了hCEACAM1蛋白定位表達(dá)于細(xì)胞膜上。由此鑒定,我們成功獲得了hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠。 四、hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠的淋病奈瑟菌感染實(shí)驗(yàn) 為研究hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠在淋病研究中的應(yīng)用價值,我們在轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)量較少的情況下,選擇了4只hCEACAM1陽性小鼠,進(jìn)行了淋病奈瑟菌體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相對于對照組的正常小鼠,淋病奈瑟菌在hCEACAM1轉(zhuǎn)基因小鼠中的存活時間顯著延長,但是沒有引起小鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)小鼠的數(shù)量嚴(yán)重不足,這只是對淋病奈瑟菌體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)的一個初步探索,不具有統(tǒng)計學(xué)意義,但其結(jié)果預(yù)示著其作為研究淋病動物模型的可能性。
【圖文】：

不同的 mRNA 剪接模式，但是具有相似的組織特異性表達(dá)模式。①小鼠 CEACAM1 基因編碼 9 個外顯子(見圖 1A) 。外顯子 1 為起始密碼子ATG，外顯子 2-5 (D1-D4)編碼 Ig 樣結(jié)構(gòu)域，外顯子 6 編碼跨膜區(qū)(TM)，通過選擇性拼接去除含有 53 個堿基對的外顯 7，把 CEACAM1 分為 CEACAM 1-L 和CEACAM1-S，，CEACAM1-L 含外顯 7，而 CEACAM1-S 在形成中外顯子 7 被剪切。外顯子 8 [TGA( S)]和外顯子 9 [TGA(L)]為兩個終止密碼子，可以選擇性使用，前者用于編碼短胞質(zhì)區(qū)，后者用于編碼長胞質(zhì)區(qū)。

然而與小鼠相比，CEACAM1-3L 亞型在人類 T 細(xì)胞中的功能機(jī)制有所不同。在小鼠上皮細(xì)胞中 CEACAM1-L 需要與 CEACAM1-S 一同起到抑制功能；而在人類 T細(xì)胞中， CEACAM1-L 能夠單獨(dú)在 TCR/CD3 復(fù)合物的 T 細(xì)胞中起到抑制效應(yīng)。小鼠的 CEACAM1 和 N-端單克隆抗體的異源性結(jié)合能夠特異性的抑制體內(nèi)Th1/Th2 激酶的表達(dá)及免疫介導(dǎo)的體外淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)和體內(nèi)半抗原介導(dǎo)的大腸炎模型遲發(fā)性超敏反應(yīng)[20]。雖然這些證據(jù)能夠清楚表明 CEACAM1 可以抑制 T細(xì)胞的功能，然而我們也要考慮到 CEACAM1 特異性抗體也具有共刺激作用[21,22它們是否具有阻斷 CEACAM1 依賴的抑制信號或引起刺激級聯(lián)反應(yīng)的能力仍然需要證實(shí)。此外，通過轉(zhuǎn)基因方法在 T 細(xì)胞內(nèi)過表達(dá) CEACAM1 剪接體（CEACAM1-4L）可以導(dǎo)致體內(nèi) T 淋巴細(xì)胞的抑制[23]。CEACAM1-L 的抑制特性可以直接影響 TCR-CD3 復(fù)合物的信號傳遞，抑制抗原特異性 CD4+T 細(xì)胞的激活（見圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R759

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本文編號：2678603