【摘要】： 毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPCs)在毛囊發(fā)育和毛囊周期調(diào)控中起主導(dǎo)作用。誘導(dǎo)毛囊形成是DPCs最為顯著的功能特征,但是體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞只有形成凝集性生長(zhǎng)后才具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力。有研究表明,細(xì)胞外基質(zhì)及毛乳頭細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子在毛囊的形成、毛囊周期的調(diào)控及毛囊中各系細(xì)胞的分化、增殖中均發(fā)揮著重要作用,并且細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)與活性受毛乳頭細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子的調(diào)控。因此,研究生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)與毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的關(guān)系將為毛囊發(fā)育、再生及重建提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 毛乳頭細(xì)胞具有凝集性生長(zhǎng)的特性,但當(dāng)細(xì)胞傳代超過(guò)六代時(shí)這種生物學(xué)特性會(huì)消失。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基pH值超過(guò)7.6時(shí),低于六代的毛乳頭細(xì)胞也會(huì)失去凝集性生長(zhǎng)特性;當(dāng)這些細(xì)胞用pH值7.2的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),其凝集性生長(zhǎng)特性又會(huì)重新恢復(fù)。這一現(xiàn)象說(shuō)明pH值與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)特性密切相關(guān),而我們推測(cè)這一現(xiàn)象可能是不同pH值培養(yǎng)環(huán)境影響了毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)因子分泌或細(xì)胞外基質(zhì)的合成,而這些生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外基質(zhì)中可能存在影響毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。因此,我們采用不同酸堿度的培養(yǎng)基培養(yǎng)低代毛乳頭細(xì)胞,觀察不同pH值培養(yǎng)環(huán)境下毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與毛乳頭細(xì)胞凝集性狀態(tài)之間的關(guān)系,從中尋找能夠影響毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)方法 第一節(jié):pH值對(duì)毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)影響 1、采用pH6.8、pH7.2、pH7.6和pH8.0四種pH值的培養(yǎng)基培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞15天,并分別在細(xì)胞培養(yǎng)的3,6,9,12,15天,采用MTT法檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞的增殖能力,采用ELISA法檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞HGF及bFGF的分泌量。 2、采用阿新藍(lán)-雪夫氏染色法檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞酸性和中性粘多糖的分泌量。 3、采用雙變量相關(guān)分析法對(duì)MTT法所測(cè)得OD值與凝集團(tuán)數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系,生長(zhǎng)因子分泌量與凝集團(tuán)數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析,若r0.5,p0.05說(shuō)明兩組資料之間存在正相關(guān)關(guān)系。 第二節(jié):生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)高代毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的初步研究 1、采用HGF,bFGF,EGF三種生長(zhǎng)因子,每種生長(zhǎng)因子分別用10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml三種濃度誘導(dǎo)高代毛乳頭細(xì)胞。 2、采用阿新藍(lán)-雪夫氏染色法檢測(cè)出現(xiàn)了凝集性生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞的酸性和中性粘多糖的合成情況。 3、采用SPSS12.0分析軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析,p0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第三節(jié):HGF與細(xì)胞外基質(zhì)在毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)中作用的相互關(guān)系的初步研究 1、接種于12孔板中的四代毛乳頭細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)基中添加物質(zhì)的不同分為木糖甙組、木糖甙+HGF、HGF抗體組,同時(shí)設(shè)DMSO組及陽(yáng)性對(duì)照組各三孔。 2、木糖甙用二甲基亞砜(DMSO)稀釋,加入培養(yǎng)液后終濃度為1mM。 3、采用木糖甙阻斷低代毛乳頭細(xì)胞合成蛋白聚糖的功能 4、采用HGF抗體中和低代毛乳頭細(xì)胞分泌的HGF的作用。 5、采用ELISA法檢測(cè)已用木糖甙阻斷其合成蛋白聚糖后的低代毛乳頭細(xì)胞HGF的分泌量。 6、采用雪夫氏及阿新藍(lán)染色法檢測(cè)與HGF抗體共培養(yǎng)12天的低代毛乳頭細(xì)胞以及木糖甙+40ng/mlHGF組毛乳頭細(xì)胞的酸性和中性粘多糖的合成情況。 7、采用SPSS12.0分析軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析,p0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 第一節(jié):pH值對(duì)毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的影響 1、pH7.2和pH7.6培養(yǎng)環(huán)境下的毛乳頭細(xì)胞出現(xiàn)了凝集性生長(zhǎng),而在pH6.8和pH8.0培養(yǎng)環(huán)境下的毛乳頭細(xì)胞未見有凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)。 2、阿新藍(lán)-雪夫氏染色顯示,毛乳頭細(xì)胞在pH7.2和pH7.6培養(yǎng)環(huán)境下既分泌酸性,又分泌中性粘多糖,且這兩種培養(yǎng)條件下的毛乳頭細(xì)胞阿新藍(lán)-雪夫氏染色后的顯色情況與陽(yáng)性對(duì)照組的低代毛乳頭細(xì)胞的染色情況相同,而在pH6.8和pH8.0培養(yǎng)環(huán)境下中性粘多糖合成正常,但幾乎不合成酸性粘多糖。 3、MTT法所測(cè)得OD值與毛乳頭細(xì)胞的凝集團(tuán)數(shù)經(jīng)雙變量相關(guān)性分析后,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)毛乳頭細(xì)胞增殖能力的OD值與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)團(tuán)數(shù)之間無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(r0.5,p0.05)。HGF分泌量和凝集團(tuán)數(shù)經(jīng)過(guò)雙變量相關(guān)性分析后,發(fā)現(xiàn)毛乳頭細(xì)胞的HGF分泌量與其凝集性生長(zhǎng)團(tuán)數(shù)之間有正相關(guān)關(guān)系(r0.5,p0.05)。 第二節(jié):生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)高代毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)的初步研究 1、40ng/ml濃度的HGF誘導(dǎo)下的八代毛乳頭細(xì)胞出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng),其它各種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)下的毛乳頭細(xì)胞均無(wú)凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)。 2、阿新藍(lán)-雪夫氏染色結(jié)果顯示,HGF誘導(dǎo)八代毛乳頭細(xì)胞形成凝集性生長(zhǎng)時(shí),大部分毛乳頭細(xì)胞胞漿內(nèi)既有紅色又有藍(lán)色,一部分細(xì)胞胞漿內(nèi)則完全為藍(lán)色,還有少部分細(xì)胞胞漿內(nèi)為紅色。毛乳頭細(xì)胞凝集區(qū)域內(nèi)紅色和藍(lán)色的顯色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于非凝集區(qū)的顯色強(qiáng)度,40ng/mlHGF誘導(dǎo)下的八代毛乳頭細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照組毛乳頭細(xì)胞阿新藍(lán)-雪夫氏染色情況基本相同。 第三節(jié):HGF與細(xì)胞外基質(zhì)在毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)中作用的相互關(guān)系的初步研究 1、木糖甙組的四代毛乳頭細(xì)胞無(wú)凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)。木糖甙+HGF組的四代毛乳頭細(xì)胞無(wú)凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)。40μg/mlHGF抗體組的四代毛乳頭細(xì)胞亦無(wú)凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)。 2、40μg/mlHGF抗體組的四代毛乳頭細(xì)胞,木糖甙組的四代毛乳頭細(xì)胞及木糖甙+HGF組的四代毛乳頭細(xì)胞雪夫氏-阿新藍(lán)染色后中性粘多糖呈陽(yáng)性而酸性粘多糖均為陰性。 3、ELISA檢測(cè)結(jié)果表明木糖甙組毛乳頭細(xì)胞的HGF分泌量明顯少于陽(yáng)性對(duì)照組毛乳頭細(xì)胞的HGF分泌量(p0.05)。木糖甙組與20μg/mlHGF抗體組毛乳頭細(xì)胞的HGF分泌量在各時(shí)間點(diǎn)上均無(wú)明顯差異(p0.05)。 結(jié)論 1、HGF與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)有較大相關(guān)性,毛乳頭細(xì)胞的增殖能力與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)無(wú)相關(guān)性。 2、HGF能夠誘高代毛乳頭細(xì)胞出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)。 3、酸性粘多糖是乳頭細(xì)胞形成凝集性生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ),HGF是通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)中的酸性粘多糖對(duì)毛乳頭細(xì)胞的凝集產(chǎn)生作用。 4、毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的最佳pH值范圍是pH7.2-pH7.6。
【圖文】：

結(jié) 果1. 毛乳頭細(xì)胞形態(tài)學(xué)及毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)觀察結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察內(nèi)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞見 pH6.8 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)最差，細(xì)胞折光率輪廓不清，培養(yǎng)基中常有死細(xì)胞漂浮。pH7.2，pH7.6 及 pH8.0 培養(yǎng)條件下的胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞折光率高，細(xì)胞輪廓清晰。pH7.2 和 pH7.6 培養(yǎng)條件下出生長(zhǎng)(照片 1-4、5)，，pH6.8 和 pH8.0 培養(yǎng)條件下未見到凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)(照片 pH7.2 培養(yǎng)條件下毛乳頭細(xì)胞凝集性生長(zhǎng)出現(xiàn)時(shí)間較 pH7.6 培養(yǎng)條件下晚，第 8 天后凝集團(tuán)數(shù)仍持續(xù)增加。pH7.6 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)至第 8 團(tuán)數(shù)不再增加。各種 pH 條件下的毛乳頭細(xì)胞凝集團(tuán)數(shù)變化趨勢(shì)見圖 1。不同件下各時(shí)相點(diǎn)凝集團(tuán)數(shù)見表 1。新分離的毛乳頭及第一代毛乳頭細(xì)胞形態(tài)見、2、3

a、b、c、d、e 代表 pH7.2 條件下各時(shí)相點(diǎn)凝集團(tuán)數(shù)，A、B、C、D、E 代表 pH7.2 條件點(diǎn)凝集團(tuán)數(shù)。其中 d、e 之間，C、D 之間，D、E 之間,C、c 之間無(wú)差異(p>0.05)，其它間均有差異(p<0.05)。2. 四種酸堿度條件下毛乳頭細(xì)胞的增殖情況：從圖 2 可以看出 pH7.6 條件下潛伏期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖明顯加快，且明顯快于其它培養(yǎng)條件下的增<0.05)，pH8.0 培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)第 5 天潛伏期后進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，增殖明顯加殖速度低于 pH7.6 培養(yǎng)條件下的速度(p<0.05)。pH7.2 培養(yǎng)條件下的潛伏期與期無(wú)明顯界限，其增殖速度一直較為平緩，除第 6 與第 9 天與 pH8.0 培養(yǎng)條異外(p>0.05)，其它時(shí)相點(diǎn)均慢于 pH7.6 及 pH8.0 培養(yǎng)條件下的增殖速度(p<0.8 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細(xì)胞增殖速度始終慢于其它培養(yǎng)條件下的速度(p<0.T 法所測(cè)得 OD 值與凝集團(tuán)數(shù)之間的關(guān)系經(jīng)過(guò)一元線性回歸的方法進(jìn)行分析.05。不同 pH 值培養(yǎng)條件下各時(shí)相點(diǎn)測(cè)得 OD 值所繪曲線圖見圖 2。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R751

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李玉平;P16蛋白在人毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)其生長(zhǎng)特性的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2658612