【摘要】： 毛乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)在毛囊發(fā)育和毛囊周期調控中起主導作用。誘導毛囊形成是DPCs最為顯著的功能特征,但是體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞只有形成凝集性生長后才具有誘導毛囊形成的能力。有研究表明,細胞外基質及毛乳頭細胞所分泌的生長因子在毛囊的形成、毛囊周期的調控及毛囊中各系細胞的分化、增殖中均發(fā)揮著重要作用,并且細胞外基質的表達與活性受毛乳頭細胞分泌的生長因子的調控。因此,研究生長因子和細胞外基質與毛乳頭細胞凝集性生長的關系將為毛囊發(fā)育、再生及重建提供重要的實驗依據。 毛乳頭細胞具有凝集性生長的特性,但當細胞傳代超過六代時這種生物學特性會消失。在實驗中我們發(fā)現,當培養(yǎng)基pH值超過7.6時,低于六代的毛乳頭細胞也會失去凝集性生長特性;當這些細胞用pH值7.2的培養(yǎng)基培養(yǎng)時,其凝集性生長特性又會重新恢復。這一現象說明pH值與毛乳頭細胞的凝集性生長特性密切相關,而我們推測這一現象可能是不同pH值培養(yǎng)環(huán)境影響了毛乳頭細胞的生長因子分泌或細胞外基質的合成,而這些生長因子或細胞外基質中可能存在影響毛乳頭細胞凝集性生長的關鍵因子。因此,我們采用不同酸堿度的培養(yǎng)基培養(yǎng)低代毛乳頭細胞,觀察不同pH值培養(yǎng)環(huán)境下毛乳頭細胞生長因子的分泌和細胞外基質的合成與毛乳頭細胞凝集性狀態(tài)之間的關系,從中尋找能夠影響毛乳頭細胞凝集性生長的關鍵因素。實驗方法 第一節(jié):pH值對毛乳頭細胞凝集性生長影響 1、采用pH6.8、pH7.2、pH7.6和pH8.0四種pH值的培養(yǎng)基培養(yǎng)毛乳頭細胞15天,并分別在細胞培養(yǎng)的3,6,9,12,15天,采用MTT法檢測毛乳頭細胞的增殖能力,采用ELISA法檢測毛乳頭細胞HGF及bFGF的分泌量。 2、采用阿新藍-雪夫氏染色法檢測毛乳頭細胞酸性和中性粘多糖的分泌量。 3、采用雙變量相關分析法對MTT法所測得OD值與凝集團數之間的相關關系,生長因子分泌量與凝集團數之間的相關關系進行分析,若r0.5,p0.05說明兩組資料之間存在正相關關系。 第二節(jié):生長因子誘導高代毛乳頭細胞凝集性生長的初步研究 1、采用HGF,bFGF,EGF三種生長因子,每種生長因子分別用10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml三種濃度誘導高代毛乳頭細胞。 2、采用阿新藍-雪夫氏染色法檢測出現了凝集性生長的毛乳頭細胞的酸性和中性粘多糖的合成情況。 3、采用SPSS12.0分析軟件對計量資料進行單因素方差分析,p0.05時有統計學意義。 第三節(jié):HGF與細胞外基質在毛乳頭細胞凝集性生長中作用的相互關系的初步研究 1、接種于12孔板中的四代毛乳頭細胞根據培養(yǎng)基中添加物質的不同分為木糖甙組、木糖甙+HGF、HGF抗體組,同時設DMSO組及陽性對照組各三孔。 2、木糖甙用二甲基亞砜(DMSO)稀釋,加入培養(yǎng)液后終濃度為1mM。 3、采用木糖甙阻斷低代毛乳頭細胞合成蛋白聚糖的功能 4、采用HGF抗體中和低代毛乳頭細胞分泌的HGF的作用。 5、采用ELISA法檢測已用木糖甙阻斷其合成蛋白聚糖后的低代毛乳頭細胞HGF的分泌量。 6、采用雪夫氏及阿新藍染色法檢測與HGF抗體共培養(yǎng)12天的低代毛乳頭細胞以及木糖甙+40ng/mlHGF組毛乳頭細胞的酸性和中性粘多糖的合成情況。 7、采用SPSS12.0分析軟件對計量資料進行單因素方差分析,p0.05時有統計學意義。 實驗結果: 第一節(jié):pH值對毛乳頭細胞凝集性生長的影響 1、pH7.2和pH7.6培養(yǎng)環(huán)境下的毛乳頭細胞出現了凝集性生長,而在pH6.8和pH8.0培養(yǎng)環(huán)境下的毛乳頭細胞未見有凝集性生長出現。 2、阿新藍-雪夫氏染色顯示,毛乳頭細胞在pH7.2和pH7.6培養(yǎng)環(huán)境下既分泌酸性,又分泌中性粘多糖,且這兩種培養(yǎng)條件下的毛乳頭細胞阿新藍-雪夫氏染色后的顯色情況與陽性對照組的低代毛乳頭細胞的染色情況相同,而在pH6.8和pH8.0培養(yǎng)環(huán)境下中性粘多糖合成正常,但幾乎不合成酸性粘多糖。 3、MTT法所測得OD值與毛乳頭細胞的凝集團數經雙變量相關性分析后,發(fā)現反應毛乳頭細胞增殖能力的OD值與毛乳頭細胞的凝集性生長團數之間無明顯相關關系(r0.5,p0.05)。HGF分泌量和凝集團數經過雙變量相關性分析后,發(fā)現毛乳頭細胞的HGF分泌量與其凝集性生長團數之間有正相關關系(r0.5,p0.05)。 第二節(jié):生長因子誘導高代毛乳頭細胞凝集性生長的初步研究 1、40ng/ml濃度的HGF誘導下的八代毛乳頭細胞出現凝集性生長,其它各種生長因子誘導下的毛乳頭細胞均無凝集性生長出現。 2、阿新藍-雪夫氏染色結果顯示,HGF誘導八代毛乳頭細胞形成凝集性生長時,大部分毛乳頭細胞胞漿內既有紅色又有藍色,一部分細胞胞漿內則完全為藍色,還有少部分細胞胞漿內為紅色。毛乳頭細胞凝集區(qū)域內紅色和藍色的顯色強度明顯強于非凝集區(qū)的顯色強度,40ng/mlHGF誘導下的八代毛乳頭細胞與陽性對照組毛乳頭細胞阿新藍-雪夫氏染色情況基本相同。 第三節(jié):HGF與細胞外基質在毛乳頭細胞凝集性生長中作用的相互關系的初步研究 1、木糖甙組的四代毛乳頭細胞無凝集性生長出現。木糖甙+HGF組的四代毛乳頭細胞無凝集性生長出現。40μg/mlHGF抗體組的四代毛乳頭細胞亦無凝集性生長出現。 2、40μg/mlHGF抗體組的四代毛乳頭細胞,木糖甙組的四代毛乳頭細胞及木糖甙+HGF組的四代毛乳頭細胞雪夫氏-阿新藍染色后中性粘多糖呈陽性而酸性粘多糖均為陰性。 3、ELISA檢測結果表明木糖甙組毛乳頭細胞的HGF分泌量明顯少于陽性對照組毛乳頭細胞的HGF分泌量(p0.05)。木糖甙組與20μg/mlHGF抗體組毛乳頭細胞的HGF分泌量在各時間點上均無明顯差異(p0.05)。 結論 1、HGF與毛乳頭細胞的凝集性生長有較大相關性,毛乳頭細胞的增殖能力與毛乳頭細胞的凝集性生長無相關性。 2、HGF能夠誘高代毛乳頭細胞出現凝集性生長。 3、酸性粘多糖是乳頭細胞形成凝集性生長的物質基礎,HGF是通過細胞外基質中的酸性粘多糖對毛乳頭細胞的凝集產生作用。 4、毛乳頭細胞培養(yǎng)環(huán)境的最佳pH值范圍是pH7.2-pH7.6。
【圖文】：

結 果1. 毛乳頭細胞形態(tài)學及毛乳頭細胞凝集性生長觀察結果：倒置顯微鏡下觀察內培養(yǎng)的毛乳頭細胞見 pH6.8 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細胞生長最差，細胞折光率輪廓不清，培養(yǎng)基中常有死細胞漂浮。pH7.2，pH7.6 及 pH8.0 培養(yǎng)條件下的胞生長良好，細胞折光率高，細胞輪廓清晰。pH7.2 和 pH7.6 培養(yǎng)條件下出生長(照片 1-4、5)，，pH6.8 和 pH8.0 培養(yǎng)條件下未見到凝集性生長出現(照片 pH7.2 培養(yǎng)條件下毛乳頭細胞凝集性生長出現時間較 pH7.6 培養(yǎng)條件下晚，第 8 天后凝集團數仍持續(xù)增加。pH7.6 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細胞培養(yǎng)至第 8 團數不再增加。各種 pH 條件下的毛乳頭細胞凝集團數變化趨勢見圖 1。不同件下各時相點凝集團數見表 1。新分離的毛乳頭及第一代毛乳頭細胞形態(tài)見、2、3

a、b、c、d、e 代表 pH7.2 條件下各時相點凝集團數，A、B、C、D、E 代表 pH7.2 條件點凝集團數。其中 d、e 之間，C、D 之間，D、E 之間,C、c 之間無差異(p>0.05)，其它間均有差異(p<0.05)。2. 四種酸堿度條件下毛乳頭細胞的增殖情況：從圖 2 可以看出 pH7.6 條件下潛伏期后進入對數生長期，增殖明顯加快，且明顯快于其它培養(yǎng)條件下的增<0.05)，pH8.0 培養(yǎng)條件下經過第 5 天潛伏期后進入對數增長期，增殖明顯加殖速度低于 pH7.6 培養(yǎng)條件下的速度(p<0.05)。pH7.2 培養(yǎng)條件下的潛伏期與期無明顯界限，其增殖速度一直較為平緩，除第 6 與第 9 天與 pH8.0 培養(yǎng)條異外(p>0.05)，其它時相點均慢于 pH7.6 及 pH8.0 培養(yǎng)條件下的增殖速度(p<0.8 培養(yǎng)條件下的毛乳頭細胞增殖速度始終慢于其它培養(yǎng)條件下的速度(p<0.T 法所測得 OD 值與凝集團數之間的關系經過一元線性回歸的方法進行分析.05。不同 pH 值培養(yǎng)條件下各時相點測得 OD 值所繪曲線圖見圖 2。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R751

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 李玉平;P16蛋白在人毛乳頭細胞中的表達及對其生長特性的影響[D];河北醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2658612