【摘要】：目的:檢驗(yàn)GINS2基因在惡性黑素瘤(MM)中的表達(dá)情況,構(gòu)建靶向GINS2 sh RNA慢病毒表達(dá)載體并鑒定,為MM的基因靶向治療提供依據(jù)。方法:1、采用免疫組化染色對(duì)MM和癌旁組織中GINS2的表達(dá)進(jìn)行分析,q PCR檢測(cè)人侵襲性脈絡(luò)膜黑素瘤細(xì)胞株(MUM-2C)及人惡性黑素瘤細(xì)胞株(A375)GINS2基因表達(dá)情況;2、合成GINS2-sh RNA序列與慢病毒載體GV115接合,進(jìn)行慢病毒包裝和質(zhì)量測(cè)評(píng);3、運(yùn)用GINS2-sh RNA慢病毒轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株,通過(guò)q PCR技術(shù)檢測(cè)sh GINS2組及陰性對(duì)照組GINS2基因m RNA的表達(dá)情況;Western-blot檢測(cè)sh GINS2組及陰性對(duì)照組GINS2蛋白的表達(dá)水平,以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果:1、通過(guò)免疫組化染色示:MM組織中GINS2的表達(dá)量相比于癌旁組織明顯上升,差異有顯著性(P0.05);q PCR檢測(cè)示:GINS2在MUM-2C細(xì)胞及A375細(xì)胞中均高豐度表達(dá)(ΔCt值≤12)。2、成功合成并鑒定GINS2-sh RNA慢病毒表達(dá)載體。3、GINS2-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株后qPCR檢測(cè)示:shGINS2組中GINS2基因m RNA表達(dá)量明顯低于sh Ctrl組,差異具有極顯著性(P0.01);Western blot檢測(cè)示:sh GINS2組中GINS2蛋白含量明顯低于sh Ctrl組。結(jié)論:1、GINS2基因在MM組織及細(xì)胞中的表達(dá)均明顯增高;2、成功構(gòu)建了GINS2-sh RNA慢病毒表達(dá)載體,且成功轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株,使GINS2基因的m RNA及蛋白表達(dá)均明顯下降,證實(shí)GINS2-sh RNA重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功,為進(jìn)一步研究該基因在MM發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 GV115慢病毒載體Fig 1 GV115 Lentiviral vector酶切體系放入RNase free離心管1 μg/μL) 2μLrt Buffer 5μL0 U/μL) 1μL10 U/μL) 0.2μL水將體系配置為50μL。37℃酶切3 h，，對(duì)載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊收目的條帶。2-shRNA慢病毒載體構(gòu)建性化載體與oligoDNA 序列連接

圖 2 慢病毒包裝與質(zhì)量檢測(cè)流程Fig 2 lentivirus packaging process染細(xì)胞的人惡性黑素瘤A375細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒感染。通過(guò)觀測(cè)轉(zhuǎn)染程度，當(dāng)熒光率達(dá)到70%且細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右胞進(jìn)行抗生素篩選48h，收集細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右的使用未包裝GINS2-shRNA重組慢病毒質(zhì)粒慢病毒作為陰素瘤A375細(xì)胞株慢病毒感染與檢測(cè)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞株細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制液，將5mL細(xì)胞懸液置于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶。繼續(xù)培養(yǎng)保證0%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定 MOI 值 10 轉(zhuǎn)染慢病毒，根據(jù)慢病毒產(chǎn)
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5

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本文編號(hào)：2648498