【摘要】： 前言 蕈樣肉芽腫(MF)是一種低度惡性的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。其早期表現(xiàn)可多種多樣；病理上早期診斷尤其困難，多需要反復(fù)的活組織檢查，有時(shí)要待病情進(jìn)一步發(fā)展才能確診。免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測MF皮損中T細(xì)胞分化抗原雖可作為輔助手段，但多難以確定皮損的良惡性。淋巴細(xì)胞惡性增殖的主要特點(diǎn)是克隆性增殖，在T淋巴瘤表現(xiàn)為T細(xì)胞抗原受體(TCR)的單克隆性重排。自八十年代以來國外學(xué)者應(yīng)用Southern雜交技術(shù)(SBA)檢測TCR-β基因重排，或聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)檢測TCR-γ基因重排，但由于Southern雜交技術(shù)需要新鮮的標(biāo)本，且腫瘤細(xì)胞的數(shù)量占總被檢查數(shù)量的1％-5％才能檢測出，費(fèi)力、耗時(shí)、且具有放射性，故目前已被PCR技術(shù)取代。由于γ基因重排幾乎出現(xiàn)在所有T淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞瘤，且結(jié)構(gòu)簡單，故PCR法簡便易行。目前國外采用的技術(shù)為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/瓊脂糖凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/變性梯度凝膠電泳(DGGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(SSCP)，國內(nèi)于九十年代中期亦開展了一些類似的研究，由于引物的數(shù)量和設(shè)計(jì)及PCR產(chǎn)物的檢測手段的不同，這些研究顯示蕈樣肉芽腫(MF)的TCR-γ基因重排陽性率在52％-90％之間，雖然國外一些學(xué)者應(yīng)用PCR/DGGE、PCR/SSCP技術(shù)檢測TCR-γ基因重排的陽性率在80％-90％左右，但亦存在假陽性，如在濕疹和神經(jīng)性皮炎中亦檢測出6％的TCR-γ基因重排，我們認(rèn)為在靈敏度和特異性上應(yīng)該保持平衡。目前該研究仍處于進(jìn)一步探討中，但主要攻關(guān)點(diǎn)之一是開拓一種較強(qiáng)臨床應(yīng)用前景的 基因診斷方法。然而，目前國內(nèi)外研究中所報(bào)道的大多數(shù)方法均較繁瑣 (如多重PCR)，而且耗時(shí)、費(fèi)力，需要特殊的儀器設(shè)備(DGGE)，甚至有的檢 出率雖高，但假陽性率亦高(如PC形DGGE)，這些都影響其臨床的實(shí)用性。 為了進(jìn)一步提高該研究的臨床實(shí)用價(jià)值和科研價(jià)值，我們對(duì)不同病種、不同 種類取材標(biāo)本，在DNA提取、引物設(shè)計(jì)和檢出率等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究， 取得了一定突破。1.國內(nèi)外對(duì)于MF疾病的石蠟包埋組織提取DNA方法 上基本采用酚氯仿法，我們借鑒“一步法”，在國內(nèi)外首次用于MF疾病的石 蠟包埋組織提取DNA上，使提取DNA一步完成，且提高了MF組織的利用 率，同時(shí)采用巢式PC邵瓊脂糖凝膠電泳方法檢測TcR一，基因重排，該方 法是目前國內(nèi)外報(bào)道的最簡便、快捷、靈敏度和特異性較高的方法，該方法 使操作程序化為臨床更好應(yīng)用，提高了基因診斷的價(jià)值;同時(shí)“一步法”提 取石蠟包埋組織的血A亦可用于大量的回顧性研究;2 .MF患者外周血中 存在TCR一，基因重排，但陽性率不太高，且可以在皮損中無TCR一，基因 重排存在的情況下單獨(dú)存在，之前國內(nèi)尚未有報(bào)道。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 一、提取DNA的方法: 1.提取石蠟包埋組織DNA的“一步法”:將石蠟包埋組織切成6卿的 薄片，每例切18張，裝人離心管，常規(guī)脫蠟后，每個(gè)小管中加人變性緩沖液 100醉，55℃水浴17h。離心后留上清4℃冰箱保存?zhèn)溆�。同時(shí)應(yīng)用微衛(wèi)星 引物做PCR驗(yàn)證提取DNA的質(zhì)量。 2.提取新鮮皮損及外周血DNA采用傳統(tǒng)的酚氯仿法，將提取的DNA 用紫外分光光度計(jì)測定260lun和Zsolun的光密度(OD)，確定OD260/ OD280Iun值并根據(jù)OD值計(jì)算DNA的濃度和純度，然后用TE緩沖液調(diào)濃 度至100卜擴(kuò)d。 二、TCR一，基因的PCR擴(kuò)增: L采用TCR一，，基因的v，1一8/J，和v，9/J，引物，用巢式PcR法檢測 32例MF石蠟包埋組織的基因重排，同時(shí)對(duì)2例可疑MF(最后發(fā)展為 Mr)、5例濕疹、5例類銀屑病(急性痘瘡樣苔癬狀糠疹)、5例神經(jīng)性皮炎患 者、5例正常皮膚的石蠟包埋組織進(jìn)行TcR一，基因的檢測。 2.采用TCR一，基因的v，1一8/J，和v尹/J，引物，用巢式PCR法檢測 14例MF患者的14份外周抗凝血和14份皮損的TCR一，基因重排，同時(shí) 對(duì)17例可疑MF、8例濕疹、8例神經(jīng)性皮炎、1例紅皮病患者、5例正常人的 皮損和外周抗凝血進(jìn)行TCR一，基因的檢測。 3.采用TCR一，基因的v，1一8/J，和v尹/J，引物，用巢式PCR法檢測 28例B細(xì)胞淋巴瘤石蠟包埋組織的TCR一，基因重排。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、“一步法”和酚氯仿兩種方法對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)間的石蠟包埋組織提取 DNA的檢出率: 1.58例標(biāo)本中”一步法”和酚氯仿法提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增總陽性 數(shù)分別為45例和犯例(x，=6.52，p0.05); 2.23例保存6一10年標(biāo)本中，“一步法”和酚氯仿法提取DNA經(jīng)PCR 擴(kuò)增后陽性數(shù)分別為16例和8例(x，二5 .57，P0.05); 3.35例保存1一5年的標(biāo)本中，”一步法”與酚氯仿法提取DNA經(jīng) PcR擴(kuò)增后陽性數(shù)分別為29例和24例(xZ=1 .32P0 .05)。 二、石蠟包埋組織的TCR一，基因重排檢出結(jié)果: 1.MF患者:32例患者中有23例檢測TCR一，基因重排，其檢出結(jié)果 的陽性率為72%。其中4例三期TCR一，基因重排檢出陽性率100%，28 例二期檢出陽性率為67.9%。 2.可疑MF患者(最后發(fā)展成為MF):2例可疑MF患者中1例檢測出 TcR一，基因重排。 3.非MF患者(濕疹、神經(jīng)性皮炎、急性痘瘡樣
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王平,邱丙森,陳明華,高紅陽,單易非;原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤外周血克隆性T細(xì)胞的檢測與研究[J];臨床皮膚科雜志;1999年03期

2 宋麗新,趙玉銘,李波,宋芳吉,王鳳賢;蕈樣肉芽腫T細(xì)胞抗原受體γ基因重排的研究[J];中華皮膚科雜志;2002年01期

本文編號(hào)：2623065