【摘要】：研究背景和目的銀屑病(psoriasis)是一種由免疫介導的多基因相關慢性炎癥性皮膚病,可由感染、外傷、藥物及環(huán)境等多種因素誘發(fā),以表皮角質形成細胞(keratinocyte cell,KC)發(fā)生過度增殖和異常分化,真皮先天性和獲得性的炎性浸潤,毛細血管迂曲、新生為主要病理特征。銀屑病確切的病因和發(fā)病機制至今仍未完全闡明,病程長,易復發(fā),難治愈,臨床上許多治療銀屑病的方法雖然可以有效的緩解病情,但是仍不能防止銀屑病復發(fā)。因此,深入研究銀屑病的發(fā)病機制,并在此基礎上尋找新的有效的銀屑病治療靶點,成為當今世界皮膚科領域研究的熱點和難點。銀屑病的病因和發(fā)病機制異常復雜。研究證明,銀屑病病理生理過程中涉及到炎癥、免疫紊亂、細胞增殖與凋亡異常、細胞內信號傳導通路激活等多方面因素;其中免疫失衡是發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié),T細胞、KC、γ δ T細胞、樹突狀細胞(Dendritic Cells,DC)、中性粒細胞、自然殺傷性T細胞等多種細胞成分分泌一系列細胞因子、趨化因子,介導細胞內信號轉導通路的活化,從而在KC、固有免疫細胞、T淋巴細胞之間相互作用,產(chǎn)生級聯(lián)放大效應及惡性循環(huán),最終協(xié)同作用到皮損局部KC,誘導KC發(fā)生過度增殖和異常分化,導致銀屑病皮損炎癥反應發(fā)生。原肌球蛋白(tropomyosin,TPMs)廣泛分布于各種真核細胞中,是通過與肌動蛋白結合而穩(wěn)定微絲的細胞骨架蛋白亞型,與細胞轉移、形態(tài)發(fā)生和調節(jié)肌動蛋白絲等過程有關。TPMs家族分為兩大類,高分子量原肌球蛋白(HMW-TPMs)和低分子量(LMW-TPMs)原肌球蛋白。目前研究認為TPMs可以被Ras癌基因調節(jié),當Ras癌基因激活時,TPMs表達下調。HMW-TPMs中的TPM1被視為新的抑癌基因,在多種實體腫瘤組織中表達下調,如乳腺癌、膀胱癌、神經(jīng)母細胞瘤等,且HMW-TPMs可調節(jié)腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移,已有報道證明,在與正常成人健康皮膚組織相比,銀屑病皮損組織中原肌球蛋白的表達明顯下調。提示TPMs可能參與銀屑病的發(fā)病機制。此外,同為Ras-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路中的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)為重要的下游靶蛋白,研究證明,mTOR信號通路參與調節(jié)細胞增殖、分化和凋亡,銀屑病皮損中mTOR信號通路激活,參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin,mTOR抑制劑)又稱為西羅莫司,最初被作為抗真菌藥及免疫抑制劑,已用于抗移植物排斥反應、抗腫瘤、血管性疾病的治療,近年在糖尿病治療、神經(jīng)元的保護等方面的研究增多。在皮膚科涉及黑素瘤、結節(jié)性硬化癥、脈管畸形多方面治療作用。雷帕霉素抗腫瘤的作用主要是影響腫瘤細胞的生長、異常增殖,已有研究報道發(fā)現(xiàn)應用雷帕霉素治療銀屑病有效,應與mTOR通路有關,但其具體機制仍需進一步研究,mTOR和TPMs同受Ras-PI3K信號通路的調節(jié),同樣與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移有關,二者在銀屑病發(fā)病中的作用尚未可知,目前未見國內外有關報道。為探討雷帕霉素調控TPMs及其在銀屑病發(fā)病中的作用,本課題研究從mRNA及蛋白水平檢測TPMs在正常健康皮膚組織、銀屑病皮損及非皮損皮膚組織中的表達,篩選出表達差異的TPMs。目前的研究結果表明表觀遺傳改變,包括DNA甲基化、組蛋白修飾和乙醇化等可能在銀屑病中起重要作用,已有研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損伴有DNA甲基化改變,涉及銀屑病發(fā)病的表觀遺傳過程,且發(fā)現(xiàn)這些差異主要發(fā)生在皮損角質形成細胞中,但銀屑病的表觀遺傳改變及其發(fā)病機制尚未完全闡明,在本實驗中進一步應用甲基化特異性PCR檢測了差異表達的TPMs的甲基化水平,從而探討TPMs及其表觀遺傳修飾在銀屑病發(fā)病中的作用機制;在此基礎上,采用腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激永生化人角質形成細胞(Hacat細胞)及人表皮角質形成細胞(HEK)構建銀屑病細胞模型,分別檢測了雷帕霉素干預前后TPMs的表達及甲基化程度、胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)和mTOR的磷酸化水平,同時觀察雷帕霉素對角質形成細胞增殖、細胞骨架、周期分布的作用;并從銀屑病動物模型中進一步驗證,以研究雷帕霉素與TPMs在銀屑病發(fā)病及治療中的作用,同時為雷帕霉素應用于臨床治療銀屑病提供基礎研究。第一部分健康人皮膚及斑塊型銀屑病皮損中TPMs的表達及甲基化水平研究目的觀察TPMs mRNA在健康對照皮膚組織、斑塊型銀屑病皮損及非皮損組織中的表達水平,篩選出表達差異的TPMs,并探討其蛋白表達水平及甲基化水平。研究方法1.標本收集:收集2015年6月-2016年6月山東大學千佛山醫(yī)院皮膚科斑塊型銀屑病患者留存的皮損及非皮損組織各20例。診斷標準根據(jù)《中國銀屑病治療指南》(中華醫(yī)學會皮膚性病分會銀屑病學組,2008版)。所有患者符合入組標準(詳見正文)。另選取本院整形外科留取的健康對照皮膚標本20例,在年齡、性別、取材部位上與斑塊型銀屑病組相匹配;2.采用實時定量熒光PCR(real-time PCR)的方法檢測TPMs mRNA在斑塊型銀屑病皮損、非皮損組織及健康對照皮膚組織中的表達情況,篩選出表達差異者;同時利用HE染色觀察銀屑病皮損及健康對照皮膚組織的表皮增殖程度;3.用免疫組化二步法進一步檢測斑塊型銀屑病皮損、非皮損和健康對照組織中差異表達的TPMs的蛋白表達水平;4.利用甲基化特異性PCR檢測差異表達的TPMs啟動子的甲基化水平。結果1.real-time PCR結果顯示,與健康對照組相比,TPM1和TPM2的mRNA表達水平在斑塊型銀屑病皮損及非皮損組織中均顯著下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),且斑塊型銀屑病皮損組比非皮損組TPM1和TPM2表達水平也明顯下調(P0.01),而TPM3和TPM4的mRNA表達水平則無明顯差異;2.HE染色觀察銀屑病皮損組織的表皮層顯著厚于健康對照和非皮損組織;3.免疫組化結果:與健康對照組相比,斑塊型銀屑病皮損及非皮損組織中TPM1和TPM2蛋白表達降低;4.甲基化特異性PCR檢測出與健康對照組及非皮損組相比,斑塊型銀屑病皮損組織中TPM1和TPM2的啟動子發(fā)生甲基。結論:1.TPM1和TPM2的mRNA及蛋白表達水平在斑塊型銀屑病皮損中表達明顯下調2.TPM1和TPM2的啟動子在斑塊型銀屑病皮損中發(fā)生甲基化第二部分雷帕霉素在銀屑病細胞模型中對TPMs表達及細胞增殖的影響研究目的探討在體外銀屑病細胞模型中TPM1和TPM2的表達及雷帕霉素的調節(jié)作用,觀察雷帕霉素對體外角質形成細胞增殖的影響,從而探討雷帕霉素及TPMs參與銀屑病發(fā)病中可能的作用。研究方法1.利用TNF-α誘導體外銀屑病細胞模型;將Hacat細胞及HEK分別接種于24孔板中,濃度為1 × 104個細胞/孔,并在37 ℃C培養(yǎng)過夜。然后,將TNF-α(10 ng/ml)加入到每個孔中,刺激細胞。2.對銀屑病細胞模型進行雷帕霉素處理;利用5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-Aza)作為陽性對照,實驗分組為:1)Hacat細胞(空白對照組,不加任何藥物)2)Hacat 細胞+TNF-α(1 Ong/ml,1 小時)3)Hacat 細胞+TNF-α(l0ng/ml,1 小時)+ rapamycin(50 nM/L,1 小時)4)Hacat 細胞+TNF-α(10ng/ml,1 小時)+5-Aza(陽性對照,5 μM/L,1小時)5)HEK(空白對照組,不加任何藥物)6)HEK+TNF-α(10ng/ml.1 小時)7)HEK+TNF-α(10ng/ml,1小時)+rapamycin(50 nM/L,1 小時)8)HEK+TNF-α(lOng/ml,1 小時)+5-Aza(陽性對照,5 μM/L,1 小時)3.應用real-time PCR檢測各組TPM1和TPM2的mRNA表達水平;并用抗TPM1和抗TPM2的抗體進行免疫熒光檢測TPM1和TPM2蛋白的表達水平;4.分別于24,48和72小時應用CCK8檢測各組細胞的增殖情況,并采用EdU染色觀察各組細胞的增殖情況;5.用鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)及DAPI(細胞核)染色,檢測各組細胞骨架分布情況;6.應用流式細胞儀檢測各組細胞周期的分布情況,并統(tǒng)計三次實驗結果做統(tǒng)計學處理;7.采用Western blot檢測各組TPM1、TPM2的蛋白表達水平,并檢測了信號通路中關鍵分子ERK1/2和mTOR的磷酸化水平;8.應用甲基化特異性PCR檢測各組細胞TPM1和TPM2啟動子的甲基化水平。結果1.在TNF-α刺激后,TPM1和TPM2mRNA的表達水平與空白對照組相比均顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.001),而雷帕霉素處理后Hacat和HEK的TPM1和TPM2 mRNA表達水平則較TNF-α組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);2.免疫熒光發(fā)現(xiàn)應用TNF-α刺激細胞后,TPM1和TPM2的蛋白表達水平下調,而在TNF-α刺激的同時加入雷帕霉素,TPM1和TPM2的蛋白表達水平回升;3.TNF-α刺激24,48和72小時后,HEK和Hacat細胞的增殖水平顯著增加(P0.001),而用雷帕霉素和TNF-α同時處理后,細胞的增殖較TNF-α組明顯下降(P0.05,P0.00l),提示雷帕霉素可逆轉TNF-α引起的細胞增殖;EdU染色結果中觀察到與之一致的變化;4.發(fā)現(xiàn)在TNF-α刺激的Hacat和HEK細胞中細胞骨架均被破壞,而雷帕霉素處理后銀屑病細胞模型中細胞骨架的結構恢復;5.發(fā)現(xiàn)TNF-α引起細胞周期中S期阻滯,與空白對照組比差異顯著(P0.05),而雷帕霉素處理后則恢復細胞S期的分布,說明雷帕霉素調節(jié)銀屑病細胞模型的細胞周期分布;6.TNF-α刺激下顯著增加Hacat細胞及HEK中ERK1/2和mTOR的磷酸化水平,而雷帕霉素的處理則抑制ERK1/2及mTOR磷酸化水平;8.發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后TPM1和TPM2的啟動子出現(xiàn)甲基化,而雷帕霉素處理后TPM1和TPM2的甲基化水平則顯著下降。結論1.TNF-α誘導的銀屑病細胞模型中TPM1和TPM2的表達水平下調2.雷帕霉素抑制TPM1和TPM2啟動子的甲基化,逆轉二者在銀屑病細胞模型中的低表達3.雷帕霉素抑制體外銀屑病細胞模型的細胞增殖,并且恢復細胞的S期分布4.雷帕霉素通過調控TPM1和TPM2恢復角質形成細胞骨架的完整性5.雷帕霉素抑制銀屑病細胞模型中mTOR的磷酸化,并降低ERK1/2的磷酸化水平第三部分雷帕霉素對銀屑病動物模型TPMs的調控作用研究目的利用小鼠模型進一步驗證雷帕霉素調節(jié)TPMs在銀屑病中的作用研究方法1.使用咪喹莫特(IMQ)制備小鼠銀屑病模型,并用雷帕霉素、5-Aza干預,制備成四組動物模型;具體分組:①正常對照組(生理鹽水組,6只);②銀屑病模型組(IMQ組,背部脫毛后涂抹5%IMQ,62.5mg/cm2,每日1次,連續(xù)給藥10天,6只);③雷帕霉素治療組(IMQ+RAPA組,3.0mg/kg/體重,腹腔注射,每日1次,連續(xù)10天,6只);④5-雜氮脫氧胞苷對照組(IMQ +5-Za組,3.0 mg/kg/體重,腹腔注射,每日1次,連續(xù)10天,6只);2.利用PASI評分評價各組小鼠銀屑病模型的構建;3.應用HE染色評價各組的表皮增殖程度;4.應用免疫組化及Western blot檢測各組動物模型皮損組織中TPM1和TPM2的表達情況;5.應用Western blot檢測各組動物模型皮損組織中磷酸化ERK1/2和磷酸化mTOR的表達水平;6.應用甲基化特異性PCR檢測各組動物模型皮損組織中TPM1和TPM2的甲基化水平。結果1.IMQ誘導小鼠銀屑病模型成功;2.應用HE染色發(fā)現(xiàn),銀屑病模型組小鼠皮膚的表皮層顯著增厚,而雷帕霉素治療組則較銀屑病模型組有顯著恢復變薄,表明雷帕霉素保護IMQ引起的表皮增殖;3.應用免疫組化及Western blot檢測TPM1和TPM2在各組動物模型皮損中的表達,發(fā)現(xiàn)在銀屑病模型組顯著降低,而雷帕霉素治療組的小鼠模型皮損中,TPM1和TPM2的表達水平則恢復上調;4.銀屑病動物模型中ERK1/2和mTOR的磷酸化水平上調,而雷帕霉素的處理則抑制ERK1/2及mTOR磷酸化水平;5.在動物模型中,與前期實驗一致,銀屑病模型組TPM1和TPM2的甲基化水平顯著增加,而雷帕霉素則抑制TPM1和TPM2的甲基化。結論1.雷帕霉素在IMQ誘發(fā)的小鼠銀屑病模型中起保護作用2.TPM1和TPM2在銀屑病動物模型皮損組織中的表達下調3.雷帕霉素抑制TPM1和TPM2啟動子的甲基化,上調二者在銀屑病動物模型中的表達水平
【圖文】：

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R758.63

【參考文獻】

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1 黃丹丹;吳永貴;齊向明;張培;;雷帕霉素治療糖尿病合并銀屑病相關性腎病1例報告及文獻復習[J];安徽醫(yī)學;2010年03期

本文編號：2617456