【摘要】： 第一部分：人純化ET-1通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響 目的：探討311nm UVB對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌內(nèi)皮素(ET)-1的影響及人純化ET-1通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的作用。 方法：采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)311nm UVB對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞存活率的影響。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)311nm UVB照射人角質(zhì)形成細(xì)胞后收集的培養(yǎng)上清液中白細(xì)胞介素(IL)-1a、ET-1和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的濃度。采用相差顯微鏡觀察人純化ET-1對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響。應(yīng)用pull down方法檢測(cè)人純化ET-1對(duì)人黑素細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：在25和50mJ／cm~2劑量下，311nm UVB照射后24h對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率分別為102.55±1.82％和100.57±1.61％，，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在100和200mJ／cm~2時(shí)，存活率分別下降至91.38±2.41％和80.56±3.31％，與對(duì)照組比較明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在25和50mJ／cm~2劑量時(shí)，人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL—1a和ET-1的濃度與對(duì)照組比較明顯升高(P＜0.05)，其中ET-1在25mJ／cm~2時(shí)達(dá)到38.85±1.52pg／mL。未經(jīng)ET-1處理的人黑素細(xì)胞樹突多為雙極或三極，而經(jīng)ET-1處理的細(xì)胞胞體增大，樹突明顯增多，多于3個(gè)樹突(不包括3個(gè))以上的細(xì)胞(63.67±5.51％)較未處理細(xì)胞(28.67±3.06％)明顯增多(P＜0.01)。Pull down實(shí)驗(yàn)顯示人黑素細(xì)胞GTP-Rac1的表達(dá)在ET-1處理后逐漸升高，10 min時(shí)達(dá)到處理前的4倍，隨后逐漸下調(diào)，但處理60 min時(shí)仍高于處理前水平；而GTP-RhoA表達(dá)開(kāi)始就明顯下降，10 min時(shí)降到處理前的1／3，之后有所回升，在處理60 min時(shí)幾乎達(dá)到處理前水平。 結(jié)論：311nm UVB具有促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌ET-1及ET-1可通過(guò)活化Rac1和抑制RhoA雙重途徑促進(jìn)人黑素細(xì)胞樹突生成的作用。 第二部分：311nm UVB通過(guò)活化Rac1對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞F-actin和樹突生成的影響 目的：探討311nm UVB通過(guò)活化Rac1對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞F-actin和樹突生成的影響。 方法：采用MTT法檢測(cè)311nm UVB對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞存活率的影響。應(yīng)用相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡分別觀察311nm UVB對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響。應(yīng)用pull down方法檢測(cè)311nmUVB照射前及照射后15 min、30 min、60 min和120 min B16黑素瘤細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：在25、50和100mJ／cm~2劑量下，311nm UVB照射后24h對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)；在200和300mJ／cm~2時(shí)，B16黑素瘤細(xì)胞的存活率明顯下降，存活率分別為87.75±2.66％和79.40±2.31％(P＜0.01)。311nm UVB100 mJ／cm~2照射24h后，B16黑素瘤細(xì)胞呈胞體增大近似球狀，樹突明顯增多似樹枝，與未照光細(xì)胞比較明顯增多((P＜0.01)，而未照光細(xì)胞樹突僅表現(xiàn)為雙極或三極。激光共聚焦顯微鏡顯示，B16黑素瘤細(xì)胞在饑餓24h而未經(jīng)311nm UVB照射時(shí)，細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白張力纖維紋理清晰，而經(jīng)311nm UVB 100 mJ／cm~2照射30min和60min后細(xì)胞骨架蛋白張力纖維解聚，紋理欠清晰，并逐漸加重，在照射6h時(shí)張力纖維紋理模糊，呈團(tuán)塊狀。Pull down實(shí)驗(yàn)顯示，與照射前比較311nm UVB100 mJ／cm~2照射后15 min和30 min B16黑素瘤細(xì)胞GTP-Rac1蛋白的表達(dá)逐漸升高，尤其在30 min時(shí)表達(dá)是照射前的2倍之多，隨后略有下降，但在照射后60 min和120 min表達(dá)仍高于對(duì)照組；而GTP-RhoA蛋白在照射后略有下降，而后逐漸升高，在120min時(shí)升高到照射前的1.6倍。 結(jié)論：311nm UVB可通過(guò)活化Rac1誘導(dǎo)B16鼠黑素瘤細(xì)胞內(nèi)張力纖維F-actin的解聚，進(jìn)而促進(jìn)B16黑素瘤細(xì)胞胞體增大和樹突增多等形態(tài)學(xué)的改變。 第三部分：熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成及共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 目的：探討熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成及細(xì)胞共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 方法：MTT法檢測(cè)熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響。相差顯微鏡觀察熊果苷和淫羊藿苷對(duì)人黑素細(xì)胞樹突生成的影響。pull down方法檢測(cè)熊果苷對(duì)人黑素細(xì)胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熊果苷和淫羊藿苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 結(jié)果：熊果苷在藥物濃度320-640 mmol／L之間時(shí)抑制細(xì)胞增殖作用明顯(P＜0.05)，在40-160 mmol／L時(shí)，抑制作用不明顯；淫羊藿苷具有促細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但當(dāng)藥物濃度在120-240mmol／L之間時(shí)，促增殖作用下降。經(jīng)熊果苷(160mmol／L)處理后，黑素細(xì)胞樹突退縮，樹突平均長(zhǎng)度為110.67±7.37μm，與對(duì)照組(267±10.15μm)比較有顯著性差異(P＜0.01)；而經(jīng)淫羊藿苷處理后，黑素細(xì)胞樹突長(zhǎng)度雖略增加(285±10.54μm)，但與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熊果苷(160mmol／L)處理15 min后黑素細(xì)胞GTP-RhoA蛋白表達(dá)增多，30 min時(shí)達(dá)到高峰，60 min時(shí)表達(dá)出現(xiàn)下降，但在120 min表達(dá)仍高于對(duì)照組；GTP-Rac1蛋白的表達(dá)在15 min、30 min、60 min和120 min與處理前比較無(wú)顯著性改變。熊果苷和淫羊藿苷對(duì)黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用隨藥物濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，以熊果苷的抑制作用明顯，在160mmol／L其抑制作用與1mmol／L的煙酰胺作用相當(dāng)，抑制率為37.15±3.87％。 結(jié)論：熊果苷可通過(guò)活化RhoA誘導(dǎo)黑素細(xì)胞樹突退縮，進(jìn)而抑制黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)。
【圖文】：

多巴染色進(jìn)行人黑素細(xì)胞的鑒定(X200)

圖l一 1PE標(biāo)記的抗角蛋白染色進(jìn)行人角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定(x630)人角質(zhì)形成細(xì)胞PE標(biāo)記的抗角蛋白染色陽(yáng)性，胞漿內(nèi)見(jiàn)紅色*顆粒狀染圖1一2多巴染色進(jìn)行人黑素細(xì)胞的鑒定(X200)黑素細(xì)胞多巴染色陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)及樹突呈灰色或黑色。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R739.5

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2608362