【摘要】： 目的和意義 隨著現(xiàn)代化和工業(yè)化進(jìn)程的加快,特應(yīng)性皮炎(AD)患病率增高,是皮膚病和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。AD是一種慢性炎癥性皮膚病,易反復(fù)發(fā)作,以濕疹性皮損分布為特征。主要病理生理表現(xiàn)為苔蘚樣硬化、瘙癢性脫皮和皮膚干燥。AD是一種系統(tǒng)性功能失調(diào)性疾病,可同時觸發(fā)哮喘、過敏性鼻炎和食物過敏,伴有血漿IgE和嗜酸性粒細(xì)胞升高。已報(bào)道多種細(xì)胞參與了AD的發(fā)病,如嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞,這些細(xì)胞都與細(xì)胞因子、化學(xué)增活素和IgE等血液因子以及與微生物感染有關(guān)。雖然大多數(shù)AD患者血漿IgE升高,但AD疾病中存在一個亞組對空氣、食物過敏原無致敏性。AD疾病可分為兩個類型:內(nèi)源性和外源性。外源性AD(ADe)占AD疾病的70-80%,具有Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)的血漿IgE增高,引起IgE介導(dǎo)的致敏作用的特征。與ADe不同,內(nèi)源性AD(ADi)占AD疾病的20-30%,沒有IgE介導(dǎo)的致敏作用和過敏反應(yīng)。 高通量篩選(HTS)方法如DNA芯片和2D-PAGE/MALDI-TOF分析已開始用于AD相關(guān)候選基因的篩選。通過HTS,可以找出大量在AD中上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)或基因,同時,相互作用組工具如PPI圖能有助于核心蛋白的挑選。因?yàn)榻酉聛淼墓δ苎芯渴且粋�耗時、花費(fèi)較大的過程,所以對目標(biāo)基因的篩選顯得非常重要,因此,通過對HTS結(jié)果的計(jì)算機(jī)預(yù)測分析是作出正確選擇的關(guān)鍵。PPI圖中列出的候選基因?yàn)槔斫鈴?fù)雜的AD疾病提供了重要信息。一旦PPI預(yù)測的相互反應(yīng)配偶體得到證實(shí),將為疾病相關(guān)的基因調(diào)節(jié)途徑提供新的見解。已知與AD疾病相關(guān)的重要因素有IgE/FcεRI、抗微生物肽、細(xì)胞因子/化學(xué)增活素、蛋白酶及其受體、脂質(zhì)基因、自身抗原、細(xì)胞外基質(zhì)基因、表皮分化復(fù)合物等。在這個基礎(chǔ)上,研發(fā)出新的治療方法,并且已經(jīng)用于AD的臨床治療。盡管目前對AD的治療有多種途徑,但是AD患者在增加,能否提供有效治療方法如快速緩解嚴(yán)重癥狀的方案仍是個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此,需要更深入的研究AD的發(fā)病機(jī)理,進(jìn)一步闡明其免疫機(jī)制。 另外本研究還進(jìn)行了分子水平的環(huán)境毒理學(xué)研究。環(huán)境小分子化學(xué)物進(jìn)入體內(nèi),可以與體內(nèi)最主要的生物大分子一蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,除了通過共價(jià)作用形成蛋白加合物外,環(huán)境化學(xué)物可能會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象,導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊,從而產(chǎn)生環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)。這種途徑是否與折疊病的環(huán)境因素有關(guān),迄今為止,這方面的報(bào)道較少,有必要開展深入研究。本研究以腦型肌酸激酶(CK-BB)為模型,試圖探討小分子化合物對酶的結(jié)構(gòu)與功能影響。在了解CK-BB去折疊與再折疊過程基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對日常生活中人群接觸的頻率較高的十二烷基硫酸鈉(SDS)作用及與CK-BB結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了探討,而且闡述了兩種可能與退行性疾病相關(guān)的環(huán)境化學(xué)物,丙烯酰胺與鋅離子,對CK-BB的結(jié)構(gòu)與功能影響的作用機(jī)制。 研究方法 1.本研究中對患者活檢樣本、原代細(xì)胞培養(yǎng)(角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)和血清樣本中的基因改變進(jìn)行研究。所有的AD樣本分為外源性(ADe)和內(nèi)源性(ADi)兩型。非特異性正常對照組(n=22),均無個人或家族史,過敏性疾病癥狀和體征,其樣本選自整形外科手術(shù)取下的皮膚。從ADe和ADi患者(n=40)皮損處取直徑3-5mm活檢樣本。20名ADe患者(SCORAD:50.09±15.68),20名ADi患者(SCORAD:46.38±11.77)。ADe組和ADi組總IgE水平、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和年齡的平均值分別為:1739 U/mL,625/μL and 27.4歲和105U/mL,248/μL and 28.2歲。所有樣本均取自于男性。血清按照之前報(bào)道的方法收集,等分試樣后儲藏在-80℃。 DNA芯片的制備按照RNA制備、標(biāo)記和雜交步驟進(jìn)行:分別準(zhǔn)備正常對照、ADe、ADi樣本,每個樣本均進(jìn)行cDNA模板合成和標(biāo)記。分別采用兩種芯片對不同樣本進(jìn)行檢測:GeneChip~(?)人U133 Plus 2.0芯片和GenePlorerTwinchip人-8K芯片�；虮磉_(dá)比值經(jīng)過圖像分析,并用LOWESS回歸方程標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用SAM和DEG。選擇q值(按照5%)有明顯表達(dá)差異(＞2倍)的基因。GeneChip~(?)人U133 P1us 2.0芯片用來進(jìn)行ADe和ADi皮膚組織的分析,而GenePlorer Twinchip人-8K芯片用于分析特應(yīng)性角質(zhì)形成細(xì)胞。自流電泳(FFE)和2-DE分別用于特應(yīng)性成纖維細(xì)胞和血清處理分析�；颊咴葱匝褰�(jīng)多重親和移除柱(MARC)處理后進(jìn)行2-DE分析。接下來,用苯基瓊脂糖樹脂分段式方法進(jìn)行AD血清蛋白質(zhì)的分析。血清經(jīng)柱子分離后TCA沉淀。 根據(jù)以上結(jié)果,可采組學(xué)工具來進(jìn)行核心基因和蛋白質(zhì)的預(yù)測。PPI預(yù)測使用了PPI的主要算法,包括:1)蛋白結(jié)構(gòu)相互作用使用PSIMAP(蛋白質(zhì)組圖譜),一種使用SCOP(蛋白結(jié)構(gòu)分類)數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)域的方法;2)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)性相互作用PEIMAP(蛋白質(zhì)組圖譜),是一種普遍的使用實(shí)驗(yàn)性蛋白相互反應(yīng)信息資源的方法,如HPRD、BIND、DIP、MINT、IntAct和BioGid。 2.重組人CK-BB按照之前報(bào)道的方法進(jìn)行表達(dá)和純化。CK-BB活性測定采用ATP和肌酸反應(yīng)釋放質(zhì)子,在百里酚藍(lán)指示劑存在下,其597nm光吸收變化速率對應(yīng)于酶活性。內(nèi)源熒光和ANS結(jié)合光譜方法檢測CK-BB三級結(jié)構(gòu)的影響。采用圓二色譜分光光度計(jì),在190-250nm范圍內(nèi)記錄遠(yuǎn)紫外圓二色譜(CD)光譜檢測CK-BB二級結(jié)構(gòu)的影響。等溫滴定微量量熱法采用3101TAMⅢ恒溫箱按照之前報(bào)道的方法進(jìn)行測量。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中獲得已知的CK-BB同源性結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)同系物牛的視黃醛肌酸激酶A鏈(PDB編碼:1g0w)是一個良好的CK-BB結(jié)構(gòu)模板(含97%相同序列)。結(jié)合模擬操作分為:1)計(jì)算相應(yīng)的受體和3D配體,2)對接大小特征,3)計(jì)算網(wǎng)格評分,4)決定補(bǔ)充受體和配體對接。 結(jié)果 1.Affymetrix芯片檢測出406種差異表達(dá)基因(DEG),在正常人和AD患者(ADe和ADi)之間,鑒別出130個DEG;在正常人和ADe患者之間,鑒別出327個DEG;在正常人和ADi患者之間,鑒別出146個DEG。8K cDNA芯片結(jié)果顯示在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞AD疾病中有157個基因失調(diào)。接下來,通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中獲得93個候選基因。MARC處理后的AD血清樣本檢測到30個上調(diào)蛋白質(zhì)和19個下調(diào)蛋白質(zhì)。改進(jìn)分段方法,檢測到9個失調(diào)基因。Affymetrix芯片分析利用PSIMAP和PEIMAP兩種不同的生物信息學(xué)計(jì)算方法得到5個和8個核心基因,分別是:PIK3R1、IGF1R、MAPK13、SFN、YWHAE和CORIN、COL14A1、CLCA4、PTPRC、IL10RA、C1S、PHLPP、SLITRK6。應(yīng)用8K cDNA芯片在角質(zhì)形成細(xì)胞中找出25個基因。通過FFE在AD成纖維細(xì)胞中4個核心蛋白在PSIMAP和PEIMAP算法中均檢測到,即:I55423、ARR3、YWHAE和EEF1A1。AD血清樣本的2-DE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)26種蛋白質(zhì)。AD組織中SFN和PTPRC經(jīng)實(shí)時PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SFN在ADi中上調(diào)4.5倍,PTPRC在ADe和ADi中分別下調(diào)60%和46%。ELISA結(jié)果顯示,MMP1和MMP10在ADi患者中均上調(diào)。ADi患者血清的ELISA研究結(jié)果表明,與正常人和ADe患者相比較,MMP1和MMP10顯著上調(diào)(幾乎兩倍),均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,采用隨機(jī)配對和Wilcoxon檢測。 2.對SDS使CK-BB的折疊后的失活進(jìn)行了研究。SDS能非競爭性抑制CK-BB的活性(K_i=1.22mM)。SDS與CK-BB暴露的疏水表面結(jié)合誘導(dǎo)其三級結(jié)構(gòu)的改變。SDS配體結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)的改變?nèi)珈�、吉布斯自由能和熵分別為-13±7.0MJ/mol,8.39 kJ/mol and-42.754 kJ/(K·mol)。研究明確了重要的CK-BB結(jié)構(gòu)以及和SDS相互反應(yīng)的折疊和抑制動力學(xué)信息。預(yù)測的結(jié)構(gòu)具有0.51(?)的均方根偏差。CK-BB與SDS之間對接成功,具有顯著性評分(-4.67 kcal/mol,自動對接4和-48.32 kcal/mol,DOCK6)。丙烯酰胺對腦型肌酸激酶(CK-BB)的抑制效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn),CK-BB能被動態(tài)的失活并伴隨疏水表面的暴露。丙烯酰胺主要與CK-BB的硫氫基(-SH)殘基相互作用導(dǎo)致烷化。計(jì)算機(jī)模擬對接支持丙烯酰胺直接結(jié)合到CK-BB的活性位點(diǎn)上,主要與CYS74和GLY73殘基相互作用。Zn~(2+)通過劑量依賴效應(yīng)失活CK-BB(IC50=0.06 mM)。Zn~(2+)顯著誘導(dǎo)CK-BB疏水基表面破裂導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)改變。還發(fā)現(xiàn)Zn~(2+)能使CK-BB發(fā)生聚沉。聚沉依賴于溫度以及酶和Zn~(2+)的濃度。 結(jié)論 1.為了更深入了解AD發(fā)病機(jī)制,明確在AD病情發(fā)展中有多少基因起作用,進(jìn)行了大規(guī)模的微陣列研究,得到許多新的相關(guān)信息。結(jié)果主要集中在AD相關(guān)基因大規(guī)模DNA芯片研究的描述上,這將為全面了解AD疾病提供新的見解,但是結(jié)果中尚不包括詳細(xì)的功能研究。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了AD皮膚組織的研究并檢測到了核心基因。然后進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的研究。同時還對AD患者血清中蛋白質(zhì)差異表達(dá)進(jìn)行了研究。已知多種因子參與了AD的發(fā)病,不同的患者中存在多種觸發(fā)因素,本研究數(shù)據(jù)提示人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞活化在AD疾病中起作用。然而,在原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中檢測到的蛋白質(zhì)或基因可能提示著體內(nèi)也存在相應(yīng)的蛋白質(zhì)變化,但是mRNA水平和表達(dá)的蛋白質(zhì)水平之間的差異干擾了對AD中準(zhǔn)確作用的理解。 大規(guī)模的芯片研究結(jié)果能有助于深入了解AD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜的相關(guān)因素。結(jié)合表達(dá)數(shù)據(jù)分析和蛋白質(zhì)相互作用組預(yù)測能找到更可靠的與AD疾病相關(guān)的基因。預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用配體和核心蛋白能為下一步AD治療的功能研究提供有效、可靠的靶點(diǎn)。AD患者數(shù)量迅速增多,急需找到特異性診斷和敏感性治療方法。因此,OMICS手段的應(yīng)用改善了對AD皮膚組織的表達(dá)形式以及組分如角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的研究。根據(jù)本研究,得出以下結(jié)論:1)生物信息學(xué)工具結(jié)合HTS數(shù)據(jù)篩選新的核心基因或蛋白,在今后的功能學(xué)研究和臨床藥物開發(fā)中將發(fā)揮重要作用;2)本研究中發(fā)現(xiàn)多個在AD源性樣本中表達(dá)顯著改變的重要基因,如SFN、PTPRC、MMP1和MMP10,可能是AD疾病的生物學(xué)標(biāo)記;3)本研究中預(yù)測出的大部分核心蛋白、以及實(shí)時PCR檢測出的候選基因/蛋白在之前關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的研究中未見報(bào)道;4)結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和相互作用組分析方法等研究手段將有助于AD復(fù)雜病理機(jī)制的研究,以及準(zhǔn)確的生物標(biāo)記物或臨床治療靶點(diǎn)的探測。 2.本部分研究我們以腦型肌酸激酶(CK-BB)為模型,探討了小分子工業(yè)化學(xué)物通過影響酶的結(jié)構(gòu)和功能,引發(fā)蛋白質(zhì)錯去折疊,導(dǎo)致酶的失活以及聚沉的毒理途徑。不管是SDS(兩親變性劑),丙烯酰胺(巰基加合物),還是Zn2+(金屬離子),都可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)疏水表面的暴露。尤其是Zn2+促發(fā)CK-BB發(fā)生聚沉。這種由小分子化學(xué)物誘發(fā)的聚沉現(xiàn)象在許多退行性病變中可能具有重要的意義,其確切的病理價(jià)值有待進(jìn)一步深入研究。環(huán)境中存在大量的具有慢性神經(jīng)毒作用的工業(yè)化學(xué)品。這些小分子化學(xué)物是含具有協(xié)同作用,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的變化將是一個重要的研究課題。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R758.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2598623