【摘要】：皮膚真菌病是人畜共患接觸性皮膚傳染病,又稱脫毛癬,對人和動物健康形成極大的威脅。皮膚真菌包括三個屬,即毛癬菌屬(Trichophytonsp)、小孢子菌屬(Microsporumsp)和表皮癬菌屬(Epidermophytonsp),它們可以侵犯皮膚、毛發(fā)和指(趾)甲,寄生或腐生于表皮角質(zhì)、毛發(fā)和甲板的角蛋白組織中,引起淺部真菌病。引起家兔皮膚真菌病的病原菌主要是須毛癬菌(Trichonphyton mentagrophyton),石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum),犬小孢子菌(Microsporum canis)。不論是從家兔皮膚病灶處或從非病灶處分離到這三種菌均視為異常,因為非病灶處的真菌很可能隨后引起皮膚病,同時造成飼養(yǎng)和實(shí)驗人員的感染。 山東為養(yǎng)兔大省,家兔皮膚真菌病已對養(yǎng)兔業(yè)造成很大損失。目前對皮膚病原真菌檢測主要是依靠真菌培養(yǎng)物的菌落形態(tài)及真菌菌絲的顯微鏡觀察。鏡檢雖然快速,但需要有多年的實(shí)踐經(jīng)驗,并很難鑒別到種。實(shí)際上,真菌的表型特征很容易受到外界因素的影響,例如溫度變化,培養(yǎng)基成份和化學(xué)治療,這些都影響真菌代謝過程,從而影響結(jié)果的觀察。而且要想得到典型的真菌菌落形態(tài)和鏡下特征一般需要2~3周的培養(yǎng)時間,對一些缺少特異的形態(tài)及鏡下特征的菌種還需要進(jìn)行特殊培養(yǎng)基的第二次培養(yǎng)。因而,建立皮膚真菌病的快速診斷方法、分離獲得山東省兔場皮膚真菌致病菌株、探明其變異現(xiàn)狀及耐藥性,對有的放矢防治該病具有重要意義。本試驗在比較了分子生物學(xué)方法和常規(guī)實(shí)驗室檢測方法分離鑒定皮膚真菌病原優(yōu)劣的基礎(chǔ)上,分離獲得了山東流行菌株,并通過對皮膚真菌的ITS區(qū)基因進(jìn)行克隆、測序,探討了分離株的變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系,然后對分離株進(jìn)行了耐藥性檢測,獲得了令人滿意的結(jié)果。本研究分以下三部分內(nèi)容: 首先,根據(jù)皮膚真菌特異性rDNA序列設(shè)計通用引物,對已知菌株及其他微生物進(jìn)行PCR檢測并克隆測序,驗證PCR方法對鑒定皮膚真菌病原的特異性、靈敏度等優(yōu)點(diǎn),結(jié)果顯示,檢測的已知菌株可在650bp-770bp之間擴(kuò)增出特異片段,但其它微生物、兔體細(xì)胞和健康種兔樣品均未擴(kuò)增出類似片段。另外,將PCR方法與常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定方法比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),檢出率前者高于后者(分別為82.8%和60.55%)。然后采用以上兩種方法從山東省主要兔場分離鑒定出9株兔源性皮膚真菌,其中須癬毛癬菌6株,石膏樣小孢子菌2株,犬小孢子菌1株。 其次,利用皮膚真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)保守序列設(shè)計通用引物,對采自山東地區(qū)主要兔場的16株皮膚真菌分離菌進(jìn)行了ITS區(qū)的克隆、測序,探討了序列變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果顯示,不同病原菌的5.8 SrDNA序列高度保守,而ITS區(qū)的變異性較高;對該區(qū)序列的聚類分析表明,不同種菌株ITS1比ITS2在堿基構(gòu)成上和序列長度有更大變異;而種內(nèi)各菌株的ITS1和ITS2在長度上均沒有變異,堿基構(gòu)成上存在微小的變異,可基于該區(qū)進(jìn)行兔皮膚真菌的分類鑒定。該研究確定了兔皮膚病原PCR檢測特異引物的靶序列,為兔皮膚真菌病病原的特異性分子鑒定提供了可靠的靶標(biāo),也為兔皮膚真菌的科學(xué)分類提供了分子依據(jù)。同時,通過對分離株ITS區(qū)的克隆、測序及分析,得出與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類不一致的結(jié)果。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類認(rèn)為:石膏樣小孢子菌和犬小孢子菌同屬小孢菌屬,須癬毛癬菌和紅色毛癬菌等均屬于毛癬菌屬;但本實(shí)驗的序列分析結(jié)果顯示:石膏樣小孢子菌與須癬毛癬菌的同源性較犬小孢子菌高。 最后,采用ATB FUNGUS 3進(jìn)行藥敏試驗,分析引起山東省家兔皮膚真菌病病原的耐藥性,結(jié)果顯示,分離的皮膚真菌病原菌均對兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、伏立康唑和伊曲康唑敏感,分別為83.33%、68.75%、75%和64.41%,而對氟康唑具有耐藥性,僅20.83%敏感。其中犬小孢子菌對兩性霉素B最為敏感(87.5%),須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌次之(81.25%)。該試驗結(jié)果為家兔皮膚真菌病的科學(xué)防治提供了科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

）上游：5’AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG 3’下游：5’CTCTTGCCGCTTCACTCG 3’；）上游：5’GTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCG 3’下游：5’GGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTG 3’；通過對以上引物特異性、擴(kuò)增片段大小等比較，篩選出最佳引物（11）命引物 rDNA1 / rDNA2。通用引物 rDNA1 / rDNA2 特異性檢測采用皮膚真菌通用引物 rDNA1 / rDNA2 對 4 株陽性菌和 5 種其他微生物性檢測，結(jié)果見圖 1。

圖 2 通用引物 PCR 擴(kuò)增 rDNA-ITS 區(qū)Fig. 2 Universal primer PCR amplification of rDNA-ITS注：M：Marker； 1-3：石膏樣小孢子菌；4-6：毛癬菌；7-9：犬小孢子菌；10：對照ote: M：Marker ; 1-3: Trichonphyton mentagrophyton; 4-6: Trichophyton ; 7-9: Microsporum canis; 10: Compar4 病料直接鏡檢病料直接鏡檢的陽性率為 67.18%（172/256），，低于通用引物 PCR的診斷結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R756

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2567936