【摘要】：白癜風(fēng)是一種臨床常見的慢性色素障礙性皮膚病,主要由病變部位黑素細(xì)胞的缺失或功能喪失引起。有關(guān)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來大量研究顯示氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞損毀中扮演了重要角色。 正常機(jī)體處于氧化-抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡之下,打破這種平衡會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。大量證據(jù)表明白癜風(fēng)患者存在氧化-抗氧化水平失衡。白癜風(fēng)中患者表皮內(nèi)過量H_2O_2蓄積,外周血紅細(xì)胞SOD活性及脂質(zhì)過氧化水平顯著升高,血漿MDA濃度增高,外周單個(gè)核細(xì)胞中DNA鏈斷裂及DNA堿基被氧化的水平升高,皮損處MSR表達(dá)水平及活性明顯下降,Nrf2漿核分布比例失調(diào),以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因多態(tài)性與白癜風(fēng)遺傳易感性相關(guān)的大量研究,直接或間接的證實(shí)氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中的重要作用。 microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子,長(zhǎng)約21-22個(gè)nt,主要與其靶基因mRNA通過特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì),在轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因進(jìn)行負(fù)表達(dá)調(diào)控。既往研究顯示miRNA分子參與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。在H_2O_2、電離輻射或依托泊甙等不同條件誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激情況下,存在多種miRNA分子表達(dá)異常改變。而在多種發(fā)病與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中,如心力衰竭、心肌病、神經(jīng)退行性疾病等,表達(dá)異常改變的miRNA分子發(fā)揮著促氧化反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激的雙向調(diào)節(jié)功能,提示miRNA分子參與機(jī)體抵御應(yīng)激反應(yīng)或?qū)е聶C(jī)體氧化應(yīng)激損傷。因此,尋找與人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的miRNA分子,研究氧化應(yīng)激條件下miRNA對(duì)黑素細(xì)胞的功能影響,探討miRNA參與黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激的分子機(jī)制,為白癜風(fēng)機(jī)理研究和臨床治療藥物開發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。 方法 使用適當(dāng)濃度的H_2O_2對(duì)永生化的人表皮黑素細(xì)胞PIG1及永生化的白癜風(fēng)患者正常黑素細(xì)胞PIG3V進(jìn)行處理,與處理前的PIG1及PIG3V黑素細(xì)胞進(jìn)行microRNA芯片表達(dá)譜差異分析,繼而通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證,初步篩選出相關(guān)miRNA進(jìn)行功能學(xué)研究。使用篩選出的miRNA分子特異性前體及抑制物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIG1及PIG3V黑素細(xì)胞,設(shè)置轉(zhuǎn)染后H_2O_2處理組,通過檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡,以及細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、GSTs的表達(dá)水平,觀察miRNA對(duì)H_2O_2處理黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)及細(xì)胞活性的影響。生物學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA可能調(diào)控靶基因,通過報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA與預(yù)測(cè)靶基因之間的關(guān)系。RT-PCR及Western Blot試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因調(diào)控作用;基因轉(zhuǎn)染、Western Blot試驗(yàn)和細(xì)胞活力檢測(cè)明確miR-423-5p/GSTM1信號(hào)通路在H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細(xì)胞氧化損傷中的作用。 結(jié)果 1.通過對(duì)miRNA芯片表達(dá)譜進(jìn)行差異分析,我們發(fā)現(xiàn)在使用H_2O_2處理后,PIG1黑素細(xì)胞中有10個(gè)miRNA分子表達(dá)水平發(fā)生改變,其中7個(gè)miRNA分子表達(dá)上調(diào),3個(gè)miRNA分子表達(dá)下調(diào);而在PIG3V黑素細(xì)胞中,則有3個(gè)miRNA分子表達(dá)上調(diào),5個(gè)表達(dá)下調(diào)。有3個(gè)miRNA分子(miR-93、miR320b和miR-423-5p)在兩種黑素細(xì)胞中表達(dá)均發(fā)生改變。進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)這3個(gè)miRNA分子進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,H_2O_2處理后miR-93和miR-320b在PIG1黑素細(xì)胞中表達(dá)較處理前下降(p0.05),在PIG3V黑素細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(p0.05),與芯片方向不完全相符;miR-423-5p在H_2O_2處理后的兩種黑素細(xì)胞中表達(dá)較處理前均上調(diào)(p0.05),且在PIG3V細(xì)胞處理前后表達(dá)水平具有顯著差異(p0.01),結(jié)果與芯片方向一致。 2.使用特異性miR-423-5p前體及抑制物轉(zhuǎn)染PIG1和PIG3V黑素細(xì)胞,能夠成功使黑素細(xì)胞中miR-423-5p的表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,在H_2O_2處理后上調(diào)miR-423-5p表達(dá)的黑素細(xì)胞,細(xì)胞活力降低,凋亡比例增大,細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MDA水平升高,而SOD、GSTs活性下降。下調(diào)miR-423-5p表達(dá)的黑素細(xì)胞活力增加,凋亡細(xì)胞減少,ROS、MDA水平降低,而SOD、GSTs活性增加。 3.通過生物學(xué)軟件我們初步預(yù)測(cè)GSTM1是miR-423-5p的靶基因。報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),GSTM1通過3’UTR位點(diǎn)與miR-423-5p結(jié)合,從而受miR-423-5p的抑制。RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,在H_2O_2處理后,與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比,特異性上調(diào)/下調(diào)miR-423-5p的表達(dá)后,GSTM1的mRNA表達(dá)無明顯變化,而蛋白水平則發(fā)生了明顯改變。進(jìn)而我們通過基因轉(zhuǎn)染、Western Blot試驗(yàn)和細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-423-5p不僅僅可負(fù)性調(diào)控GSTM1在H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細(xì)胞中的表達(dá),并確實(shí)通過下調(diào)GSTM1蛋白表達(dá)介導(dǎo)了H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細(xì)胞的氧化損傷。 結(jié)論 1. miR-423-5p在H_2O_2處理前后的人黑素細(xì)胞具有表達(dá)差異,可能參與黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。 2. miR-423-5p能夠降低H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下人黑素細(xì)胞活力,促進(jìn)黑素細(xì)胞凋亡,增加黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,降低細(xì)胞抗氧化能力。miR-423-5p是調(diào)控人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的危險(xiǎn)性因素。 3. miR-423-5p通過GSTM1介導(dǎo)人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。GSTM1具有抗氧化能力,miR-423-5p影響人黑素細(xì)胞的抗氧化能力,導(dǎo)致人黑素細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,部分是通過對(duì)GSTM1表達(dá)的負(fù)性調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文成熟加工。在細(xì)胞漿中，，pre-miRNA在Dicer酶（另一種RNase Ⅲ酶）及其輔助因子P的作用下，被剪切成具有5′端磷酸基和3′端2nt突出21-25nt長(zhǎng)度的NA:miRNA*成熟雙鏈。在TRBP募集作用下，TRBP、Argonaute蛋白與r酶三者共同形成三聚復(fù)合物，啟動(dòng)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的。雙鏈miRNA在解旋酶的作用下被解旋，其中5′端相對(duì)不穩(wěn)定的一條NA鏈整合進(jìn)RISC，結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA 的位點(diǎn)，通過堿基配對(duì)識(shí)基因發(fā)揮調(diào)控作用，另一條鏈則被特異性降解。

理濃度的增加而顯著下降。以未使用 H2O2處理的 PIG1 黑素細(xì)胞組的 OD 檢測(cè)值為 100%，當(dāng) H2O2濃度為 0.5mM 時(shí)，PIG1 黑素細(xì)胞活力開始下降(78.93±6.85)%（p<0.05）；當(dāng) H2O2濃度為 0.75mM 時(shí)，PIG1 黑素細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降(56.77±8.37)%（p<0.01）（圖 1 左）。因此，我們首先將 H2O2處理濃度固定為 0.75mM。當(dāng) H2O2處理濃度固定為 0.75mM，我們分別選取H2O2處理的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè) PIG1 黑素細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示：PIG1 黑素細(xì)胞活力隨 H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著下降。以未使用 H2O2處理的 PIG1 黑素細(xì)胞組的 OD 檢測(cè)值為 100%，當(dāng) H2O2處理 3h 時(shí)，PIG1 黑素細(xì)胞活力即開始下降(83.53±6.29)%（p<0.05）；當(dāng) H2O2處理 24h 時(shí)，PIG1 黑素細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降(58.87±5.90)%（p<0.01）（圖 1 右）。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇 0.75mM H2O2處理 24h 作為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，這主要是因?yàn)樵摑舛群蜁r(shí)間點(diǎn)下 H2O2既能誘導(dǎo) PIG1 黑素細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，又不會(huì)導(dǎo)致 PIG1 黑素細(xì)胞死亡過多而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R758.41

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2564004