發(fā)布時間：2019-11-15 21:46

【摘要】：惡性黑素瘤是一種惡性程度高、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后差的皮膚科惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率不斷增加[1]。惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同層次受多個分子的調(diào)控。迄今為止,國內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)眾多分子參與惡性黑素瘤的發(fā)生,如目前已經(jīng)確認(rèn),細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A, CDKI2A)和細(xì)胞周期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)為皮膚惡性黑素瘤的兩個高風(fēng)險性易感基因,而p14ARF基因和細(xì)胞周期素D1基因也可能是惡性黑素瘤易感基因,黑皮質(zhì)素受體-1則被確認(rèn)為惡性黑素瘤的低風(fēng)險性易感基因。但這些分子尚不能完全解釋惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的本質(zhì),提示存在著未知的分子機(jī)制,傳統(tǒng)的針對單個分子的研究與干預(yù)難以滿足需要,因此,采用新思路、新方法進(jìn)一步探索并闡明惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有非常重要的意義。 轉(zhuǎn)錄因子是一類在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的分子。研究表明,人類基因的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量,這說明一個轉(zhuǎn)錄因子“一對多”地調(diào)控下游基因的表達(dá),一個基因也受到多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制在基因表達(dá)調(diào)控中扮演了極其重要的角色,是細(xì)胞內(nèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控蛋白,與細(xì)胞分化、凋亡、癌變等多種生物現(xiàn)象密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)報道NF-KB(Nuclear transcription factor-κKB, NF-κB)[6-8]和激活蛋白(Activactor Protein,AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子參與了惡性黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此,轉(zhuǎn)錄因子活性的檢測對探究惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常有意義,轉(zhuǎn)錄因子有可能成為預(yù)測惡性黑素瘤進(jìn)展的有效標(biāo)志。 轉(zhuǎn)錄因子CUTL1(又稱CDP, CCAAT置換蛋白)屬于同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子CDP家族,其在進(jìn)化上高度保守。CUTL1定位于7q22,包含四個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中三個為Cut重復(fù)序列(CR1、CR2和CR3),一個為Cut同源結(jié)構(gòu)域。CUTL1基因全長為340kb,包含33個外顯子,2個啟動子區(qū)域,2個多腺苷酸化位點和7種選擇性剪切位點。由于選擇性轉(zhuǎn)錄起始、剪切和多腺苷酸化而產(chǎn)生了5種不同轉(zhuǎn)錄本。CUTL1在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,參與了乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展。并有文獻(xiàn)報道Wnt5A等多個基因受CUTL1調(diào)控,是CUTL1的靶標(biāo),而Wnt5A是惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的重要分子,那么是否可以推測CUTL1也參與了惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展呢?其發(fā)揮作用的機(jī)制又是什么呢?這些問題尚無確切證據(jù)可以回答。 本研究擬檢測CUTL1在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá),并從多水平、多層次驗證CUTL對惡性黑素瘤增殖能力的影響,從而證實CUTL1在惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,并初步探討CUTL1參與黑素瘤發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制,為臨床上早期診斷惡性黑素瘤,并有效控制其惡性進(jìn)展,提供重要理論根據(jù)和堅實的實驗基礎(chǔ)。 [研究目的] 1.檢測轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及意義。 2.觀察CUTL1對惡性黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 3.初步探討CUTL1參與惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制。 [研究方法] 1.免疫組化和Western blot法檢測轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在惡性黑素瘤組織和皮內(nèi)痣組織中的表達(dá),并分析其臨床病理學(xué)意義。 2. RT PCR和Western blot方法檢測惡性黑素瘤細(xì)胞系(A375、Libr和1585)和原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞中CUTL1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。 3.脂質(zhì)體法將CUTL1特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入惡性黑素瘤Libr細(xì)胞,嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆；包裝CUTL1正義逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,感染原代培養(yǎng)黑素細(xì)胞,獲得CUTL1表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞系。 4. MTT實驗、克隆形成實驗、周期和凋亡檢測等觀察轉(zhuǎn)錄因子CUTL1對轉(zhuǎn)染和感染細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。 5.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測干預(yù)轉(zhuǎn)錄因子CUTL1表達(dá)后,對惡性黑素瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力的影響。 6. Western blot方法檢測上述轉(zhuǎn)染和感染細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子p27和p21的蛋白表達(dá)。 [結(jié)果] 1. CUTL1在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)。 轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在皮內(nèi)痣組織中的表達(dá)陽性率為16.7%(4/24),而在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)陽性率為82.4%,其明顯高于皮內(nèi)痣組織(P0.05)。在惡性黑素瘤組織中,CUTL1的表達(dá)與TNM分期相關(guān),TNM分期中,低級別組CUTL1的表達(dá)明顯高于高級別組(P0.05),并且CUTL1的高表達(dá)與是否發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)。惡性黑素瘤細(xì)胞系(A375、Libr和1585)中均有CUTL1的表達(dá),且明顯高于其在黑素細(xì)胞中的表達(dá)。 2. CUTL1對惡性黑素瘤細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響。 感染CUTL1正義載體的黑素細(xì)胞較對照細(xì)胞,生長速度顯著加快,G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加,細(xì)胞克隆形成能力顯著增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)染CUTL1特異siRNA的惡性黑素瘤細(xì)胞Libr較對照細(xì)胞,生長明顯受到抑制,G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例明顯降低,細(xì)胞克隆形成能力減弱,裸鼠體內(nèi)成瘤能力也明顯減弱。 3. CUTL1對參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子的影響。 感染CUTL1正義載體的黑素細(xì)胞中,參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的相關(guān)分子p27和p21表達(dá)下調(diào),而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA的惡性黑素瘤Libr細(xì)胞中,p27和p21表達(dá)明顯升高。 [結(jié)論] 1.轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在惡性黑素瘤組織中的表達(dá)明顯高于皮內(nèi)痣組織,且CUTL1在惡性黑素瘤中的表達(dá)與其惡性進(jìn)展密切相關(guān)。 2.轉(zhuǎn)錄因子CUTL1可以增強(qiáng)惡性黑素瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外生長增殖的能力。 3.轉(zhuǎn)錄因子CUTL1至少部分通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)分子,促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S進(jìn)展,從而影響惡性黑素瘤細(xì)胞的生長增殖能力。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 袁曉華;砷對卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響及分子機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 王國強(qiáng);活性氧和p53在低濃度亞砷酸鈉拮抗DNA雙鏈斷裂損傷中的作用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

2 陸遜;納米二氧化硅抗肝癌細(xì)胞活性及其機(jī)理研究[D];華東理工大學(xué);2011年

3 洪巖;亞慢性砷暴露對小鼠腦組織線粒體Sdha表達(dá)影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2009年

4 林輝;兩種植物黃酮抗白血病細(xì)胞HL-60效應(yīng)及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

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本文編號：2561495