【摘要】：Notch信號通路是進化上高度保守的細胞與細胞間的信號傳導(dǎo)系統(tǒng),通過調(diào)控細胞的分化、增殖、凋亡的命運選擇,在胚胎正常發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)調(diào)控以及成體干細胞的維持中發(fā)揮重要作用。在胚胎血管發(fā)育過程中,Notch信號通路調(diào)控著動靜脈血管的分化和血管內(nèi)皮Tip細胞和Stalk細胞的命運選擇,對胚胎血管網(wǎng)絡(luò)正常結(jié)構(gòu)和功能的維持起到了關(guān)鍵作用。Notch信號通路調(diào)控的異常往往由于血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的缺陷而導(dǎo)致胚胎死亡。在成體生理性新生血管形成中,Notch信號通路的激活限制了血管的過度生成,維持了機體的穩(wěn)定。在腫瘤血管中,DLL4的表達顯著增高,阻斷DLL4激活的Notch信號通路引起了腫瘤血管的無功能性過度生成,使腫瘤的血流灌注減少而抑制了腫瘤的生長;而過表達DLL4雖然腫瘤血管的生成,但卻改善了腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和灌流功能,促進了腫瘤的生長。但與此同時,也有研究證實Notch的另一配體Jagged1能通過促進腫瘤的功能血管的形成而促進腫瘤的生長。 鑒于Notch信號通路的調(diào)控作用環(huán)境依賴性(Context-dependent)和Notch分子間的功能特異性,我們檢測了另外一個Notch配體DLL1在腫瘤血管中的作用。DLL1調(diào)控胚胎期動靜脈血管的分化和成體損傷后血管的形成。但其在腫瘤血管中的作用還沒有詳細的研究報道。我們在DLL1與腫瘤血管的研究中主要做了以下工作: 1、構(gòu)建共表達DLL1蛋白和綠色熒光蛋白(GFP)的真核表達質(zhì)粒。通過設(shè)計特異引物,利用PCR方法擴增出DLL1基因片段,測序正確后連接通過到pIRES2-EGFP質(zhì)粒中;然后對新構(gòu)建的pIRES2-EGFP-DLL1質(zhì)粒進行了酶切鑒定和測序。 2、在體外實驗中發(fā)現(xiàn)DLL1的表達促進腫瘤細胞的體外增殖。通過分別轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DLL1質(zhì)粒和pIRES2-EGFP質(zhì)粒,藥物篩選建立了穩(wěn)定表達DLL1基因和GFP基因的B16黑色素瘤細胞系;檢測發(fā)現(xiàn)DLL1激活了腫瘤細胞Notch信號通路;MTT和軟瓊脂克隆形成實驗表明DLL1的表達促進了腫瘤細胞的增殖和克隆的形成。 3、觀查到DLL1通過減少腫瘤血管的生成抑制了腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長。小鼠皮下荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)實驗組腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長長受到抑制,基因檢測發(fā)現(xiàn)Notch通路在腫瘤中激活,免疫熒光和免疫組化實驗證實血管腫瘤中血管形成減少,腫瘤組織血供障礙,缺氧程度加重,壞死增加。 結(jié)論:綜上所述,我們的研究認為DLL1在腫瘤細胞中的表達能通過腫瘤細胞間的相互作用激活HES1、HEY1等Notch下游基因,促進腫瘤細胞的增殖和克隆的形成。但在B16-DLL1腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長并沒有相應(yīng)的加速,反而受到了抑制。可能原因是腫瘤的快速增殖需要與營養(yǎng)的供應(yīng)相適應(yīng),而DLL1的表達一方面促進了腫瘤細胞的增殖,另一方面卻使腫瘤血管的生成減少,結(jié)構(gòu)紊亂,擾亂了腫瘤的血液供應(yīng),加重了腫瘤內(nèi)部缺血缺氧情況,使腫瘤組織壞死增加,從而抑制了腫瘤的生長。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖1 、Notch受體和配體的結(jié)構(gòu)（引自DumortierA. etal.IntJHematol.2005）1.3 Notch 信號的激活過程（圖 2）Notch信號激活需要三個重要的步驟：①Notch受體和配體的識別與結(jié)合。配體的DSL基序與受體的第11、12位EGF序列相互作用，激活相關(guān)的蛋白水解酶。②Notch胞內(nèi)段（NICD）從細胞膜上酶切釋放。Notch受體需要經(jīng)過兩次酶切才能釋放具有活性的NICD進入細胞核。第一次由腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶(TNF-α-converting enzyme，TACE)在S2位點酶切，釋放胞外區(qū)[9]；第二次由早老蛋白（Presenilin）依賴的γ-secretase復(fù)合物在S3位點酶切，釋放NICD[10-11]。③ NICD核內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。NICD在細胞核內(nèi)不能直接與DNA結(jié)合，首先需要通過RAM結(jié)構(gòu)域和ANK結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子CSL(CBF1/RBP-J，Su[H]，Lag1)相作用

圖2 Notch信號通路的激活（引自John Panelos et al Cancer Biology &Therapy 2008）二、Notch 信號通路對血管形成的作用1 Notch 分子在血管上的表達⑴Notch受體在血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌中都有表達：Notch1 廣泛表達在心臟和血管內(nèi)皮細胞上，，而Notch4 特異表達在血管內(nèi)皮細胞上表達[14-15]；Notch3 則主要表達在血管平滑肌細胞上[16-17]。一般認為Notch受體和配體主要表達在較大動脈血管內(nèi)皮細胞中，但在毛細血管和靜脈中也檢測到了Notch分子的表達[15-18]。 ⑵Notch配體中除了Dll3，其他配體 (DLL1，DLL4， Jagged1 和Jagged2)都能在血管內(nèi)皮細胞上檢測到[18]。其中DLL4 是被認為是血管中最重要的Notch配體，在胚胎期主要表達在小血管和毛細血管中，成體后表達下降，但在機體新生血管和腫瘤血管表達又會升高[19-20]。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

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