【摘要】： 皮膚瘙癢(pruritus)是一種迫切搔抓愿望的皮膚感覺,瘙癢是皮膚病最常見的臨床表現(xiàn),瘙癢的神經(jīng)生理學(xué)機制一直未被闡明,反復(fù)搔抓會釋放各種炎性因子加重皮膚損害,產(chǎn)生更為強烈的瘙癢-搔抓循環(huán)。皮膚瘙癢的臨床治療困難,目前仍無特效方法,組胺可以引起皮膚瘙癢,但是組胺受體拮抗劑治療特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)皮膚瘙癢的效果并不明顯,表明組胺不是特應(yīng)性皮炎等慢性皮膚瘙癢癥的主要致癢物質(zhì)。 蛋白酶活化受體2 (proteinase activated receptor-2, PAR-2)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族(G protein coupled receptor, GPCR)成員,介導(dǎo)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo),可以被絲氨酸蛋白酶激活,PAR-2在包括皮膚在內(nèi)的不同組織細(xì)胞均有表達,具有廣泛的生物學(xué)活性。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶活化受體-2與瘙癢的發(fā)生密切相關(guān),和健康人體皮膚組織相比,特應(yīng)性皮炎患者的類胰蛋白酶分泌明顯增多,皮損處傳入神經(jīng)纖維PAR-2的表達增多,皮下注射PAR-2激動劑可引起患者皮膚持續(xù)性瘙癢,提示類胰蛋白酶是一種強效內(nèi)源性致癢物質(zhì),PAR-2是治療皮膚瘙癢的有益靶點,PAR-2調(diào)控皮膚瘙癢的確切分子機制尚未闡明。本課題通過構(gòu)建被動皮膚過敏反應(yīng)(passive cutaneous anaphylaxis, PC A)與特應(yīng)性皮炎樣(atopic-like dermatitis)小鼠皮膚瘙癢模型,深入研究PAR-2調(diào)控皮膚瘙癢的分子機制。 第一部分過敏性皮膚瘙癢PAR-2作用機制研究 PAR-2是肥大細(xì)胞參與皮膚炎癥和超敏反應(yīng)的重要分子,我們通過小鼠尾靜脈注射DNP-OVA,構(gòu)建小鼠PCA模型,對PAR-2在過敏性皮膚瘙癢中的作用機制進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠尾靜脈注射DNP-OVA后搔抓次數(shù)明顯增加,與空白對照組小鼠相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。鹽酸西替利嗪與酮舍林可以明顯抑制PCA小鼠的搔抓行為,鹽酸西替利嗪與酮舍林合用,PCA小鼠的搔抓次數(shù)明顯減少,與PCA小鼠相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。亮肽素與PAR-2單克隆抗體可以明顯抑制PCA小鼠的搔抓行為,與PCA小鼠相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；非特異性IgG抗體組小鼠的搔抓次數(shù)未見明顯減少,與PCA小鼠相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。他克莫司可以明顯抑制PCA小鼠的搔抓行為,他克莫司與鹽酸西替利嗪合用PCA小鼠的搔抓次數(shù)明顯減少,與PCA小鼠相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。小鼠皮內(nèi)注射類胰蛋白酶搔抓次數(shù)明顯增加,他克莫司可以明顯抑制類胰蛋白酶誘導(dǎo)的瘙癢反應(yīng)。結(jié)果表明PAR-2是小鼠過敏性皮膚瘙癢的重要信號分子,他克莫司對于小鼠過敏性皮膚瘙癢具有明顯的抑制作用。 第二部分PAR-2調(diào)控皮膚瘙癢分子機制研究 PAR-2是治療皮膚瘙癢的有益靶點,我們通過研究藥物對PAR-2活性肽(SLIGRL-NH2)誘導(dǎo)小鼠搔抓行為的影響,探討PAR-2調(diào)控皮膚瘙癢的分子機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射SLIGRL-NH2,小鼠搔抓次數(shù)明顯增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與SLIGRL-NH2對照組相比,鹽酸西替利嗪組小鼠的搔抓次數(shù)未見明顯改變,齊留通組小鼠的搔抓次數(shù)明顯減少,吲哚美辛組小鼠的搔抓次數(shù)未見明顯改變；與SLIGRL-NH2對照組相比,他克莫司組小鼠的搔抓次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與空白對照組相比,皮內(nèi)注射PAR-2反義肽(LRGILS-NH2)小鼠的搔抓次數(shù)未見明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小鼠皮內(nèi)注射SLIGRL-NH2后,花生四烯酸類代謝產(chǎn)物白三烯B4 (LTB4)和前列腺素E2(PGE2)水平明顯增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與SLIGRL-NH2對照組相比,齊留通與他克莫司組小鼠皮膚LTB4水平明顯減少,鹽酸西替利嗪與吲哚美辛組小鼠皮膚LTB4水平未見明顯改變；與SLIGRL-NH2對照組相比，吲哚美辛與他克莫司組小鼠皮膚PGE2水平明顯減少,鹽酸西替利嗪與齊留通組小鼠皮膚PGE2水平未見明顯改變；與空白對照組相比,小鼠皮內(nèi)注射LRGILS-NH2,皮膚LTB4與PGE2水平未見明顯改變。SLIGRL-NH2刺激后,小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞LTB4分泌量明顯增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與SLIGRL-NH2對照組相比,齊留通與他克莫司組角質(zhì)形成細(xì)胞LTB4分泌量明顯減少,鹽酸西替利嗪與吲哚美辛組角質(zhì)形成細(xì)胞LTB4分泌量未見明顯改變；與空白對照組相比,SLIGRL-NH2刺激后,角質(zhì)形成細(xì)胞PGE2分泌量明顯增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與SLIGRL-NH2對照組相比,吲哚美辛與他克莫司組角質(zhì)形成細(xì)胞PGE2分泌量明顯減少,鹽酸西替利嗪與齊留通組角質(zhì)形成細(xì)胞PGE2分泌量未見明顯改變；與空白對照組相比,LRGILS-NH2刺激后,小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞LTB4與PGE2分泌量未見明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明PAR-2活性肽可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌LTB4與PGE2,其中LTB4與PAR-2活性肽誘發(fā)的皮膚瘙癢密切相關(guān)。 第三部分慢性皮膚瘙癢PAR-2作用機制研究 特應(yīng)性皮炎(AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、難治性炎癥性皮膚病,患者血清lgE水平明顯升高,AD患者慢性皮膚瘙癢的發(fā)病機制尚未闡明。我們依據(jù)文獻采用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏小鼠,建立符合臨床AD病理學(xué)特征的動物模型,從整體水平比較研究AD發(fā)病前后PAR-2表達水平的變化,探討PAR-2在慢性皮膚瘙癢中的作用機制。與空白對照組相比,小鼠OVA致敏后,致敏部位表皮、真皮層均顯著增厚,伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤；正常皮膚組織可見PAR-2陽性表達,小鼠OVA致敏后,致敏部位皮膚PAR-2陽性表達顯著增加。與空白對照組相比,小鼠OVA致敏后,致敏部位皮膚PAR-2 mRNA表達與PAR-2蛋白水平明顯增加,血清IgE與類胰蛋白酶水平明顯增加。小鼠OVA致敏后,搔抓次數(shù)明顯增加,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與OVA致敏小鼠相比,鹽酸西替利嗪(10 mg/kg)組、亮肽素組、PAR-2單克隆抗體組與他克莫司(1.0%、3.0%)組小鼠的搔抓次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明PAR-2是OVA致敏小鼠皮膚瘙癢的重要信號分子,他克莫司對于OVA致敏小鼠特應(yīng)性皮炎樣慢性皮膚瘙癢具有明顯的抑制作用。
【圖文】：

圖3.2OVA致敏BALBlc小鼠組織病理變化(x100)Fig3.2.Differenthistologicalvariables10di月觸rentBALB/cmiceelieitedbyrepeatedePieutaneou，eus妞七，t沁uwitkOVA.(A)nosensiti乙故ionwithOVA.仍)1sensiti刁欲lonwithOVA.(C)sensitiZationwithOVA.(D)3sensiti觀ionwithOVA.SkinseetionswerestainedwithHEaneX田舊inedatx100.3.3OVA小鼠免疫組化觀察空白對照組小鼠正常皮膚組織可見隊R-2陽性表達，小鼠OVA第2、3次致后，PAR一2陽性表達均進一步增加，，結(jié)果見圖3.3.1;采用Moticlm吧esAdvaneed3(MoticChinaGrouPCo，LTD)圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機選擇3個視野(光鏡25倍)，測量平均陽性面積(協(xié)m“)與平均光密度(oD)值，兩者的乘積為免疫組化陽指數(shù)。經(jīng)計算分析可見:與空白對照組(0.2183士0.047)相比，小鼠OVA第2、

1OVA致敏BALBlc小鼠免疫組化染色(X200)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R758.31

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本文編號：2550073