【摘要】：血管瘤是發(fā)生于嬰幼兒的最常見的良性腫瘤之一,主要由紊亂的血管和大量不成熟的內(nèi)皮細胞組成。發(fā)病率高達10～12%,嚴重影響患兒容貌、受累器官的功能、心理健康等,現(xiàn)代醫(yī)學主張以積極的態(tài)度對該病進行早期治療。但由于對其發(fā)病機制缺乏足夠的認識,致使治療效果整體上差強人意。 Id(DNA結(jié)合抑制因子/分化抑制因子)屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族,它通過作用于多種信號傳導(dǎo)而抑制細胞分化,促進增生和轉(zhuǎn)移,在細胞惡變和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.哺乳動物細胞含4種Id因子(Id1、Id2、Id3、Id4),這些因子參與細胞周期調(diào)節(jié)過程,包括細胞發(fā)育、成熟、生長、分化和凋亡等,其中Id1與腫瘤發(fā)生的關(guān)系最為密切。Id1通過抑制細胞分化,推進細胞周期進程、誘導(dǎo)細胞增殖、抑制衰老、誘導(dǎo)侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 鑒于Id1對于腫瘤中血管新生方面的突出作用,筆者將目光鎖定在以大量紊亂的血管及不成熟內(nèi)皮細胞為主要標志的的血管瘤上面。通過臨床標本上檢測Id1在血管瘤中的表達情況,并對體外培養(yǎng)的血管瘤細胞進行RNA干擾,以研究Id1在血管瘤發(fā)病中的作用并對其機制進行探討。 材料與方法： 第一部分：用免疫組化分別檢測12例增生期血管瘤、10例消退期血管瘤、9例血管畸形、7例淋巴管畸形組織及4例動靜脈畸形中的Id1的表達。將增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織分別用Trizol裂解液提取總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后用Id1引物進行(Real-timefluorescence quantitative PCR, RFQ-PCR)實驗,檢測兩種組織中Id1基因的mRNA表達情況,再取增生期血管瘤組織及瘤周正常皮膚組織,常規(guī)提取總蛋白,一抗二抗孵育,進行Western blot實驗,檢測兩種組織中的蛋白表達情況。 第二部分：用組織塊培養(yǎng)的方法培養(yǎng)增殖期血管瘤內(nèi)皮細胞,在細胞生長的對數(shù)期,用設(shè)計好的Id1干擾慢病毒(Id1-RNAi-lentivirus)及空載體慢病毒(Id1-NC-lentivirus)分別進行轉(zhuǎn)染,用熒光觀測、RFQ-PCR、 Western blot確認干擾成功,用MTT比色法描記干擾前后細胞生長曲線的變化、用TUNEL檢測干擾前后細胞凋亡的改變,用WESTERN blot及PCR檢測干擾前后HIF-1α水平的改變,用免疫組化的方法定性檢測干擾前后iNOS表達的改變；用ELISA檢測干擾前后VEGF的改變。用Tube formation觀測干擾前后血管瘤內(nèi)皮細胞成管能力的改變。 結(jié)果： 第一部分：免疫組化結(jié)果顯示增生期血管瘤組織中Id1表達整體呈強陽性,陽性率高達90.3%.消退期血管瘤Id1表達整體呈弱陽性趨勢,陽性率53%；血管畸形、淋巴管畸形及動靜脈畸形整體陽性率較弱,依次為52%、57%、53.7%。RFQ-PCR顯示增生期血管瘤組織中Id1的(?)nRNA水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。Western blot顯示增生期血管瘤組織中Idl的蛋白表達水平明顯高于瘤周正常皮膚組織。 第二部分：實驗結(jié)果顯示熒光觀測、RFQ-PCR、Western blot確認干擾成功。MTT比色法描記的干擾前后細胞生長曲線結(jié)果顯示：干擾后hemECs增殖能力下降,與未干擾組有顯著差異。TUNEL檢測干擾前后細胞凋亡結(jié)果顯示：干擾后hemEC凋亡明顯增多,與未干擾組有顯著差異。RFQ-PCR及WESTERN blot檢測干擾前后HIF-1α含量變化顯示：干擾后HIF-1α RNA水平并無明顯降低,但蛋白含量減少,與未干擾組有明顯差異。免疫組化的方法定性檢測干擾前后iNOS表達的改變,發(fā)現(xiàn)干擾后iNOS整體陽性率下降,陽性強度變?nèi)�。ELISA檢測干擾前后VEGF的改變,結(jié)果顯示,干擾后VEGF的含量減少,與對照組有明顯差異。Tube formation觀測干擾前后血管瘤內(nèi)皮細胞成管能力的改變,結(jié)果顯示干擾后成管能力下降,且成管持續(xù)時間減少,管壁消退快,與對照組相比有明顯差異。 結(jié)論： 第一部分：實驗結(jié)果提示,Idl在淋巴管畸形、靜脈畸形、動靜脈畸形僅在有管腔結(jié)構(gòu)的部位表達,其余部分不表達或低表達,Id1在增生期血管瘤組織中呈現(xiàn)高表達,在消退期血管瘤中低表達,且表達強度隨消退成分的多少而改變。增生期血管瘤中Id1的表達在RNA水平及蛋白水平均高于瘤周正常皮膚組織,提示Id1在血管瘤發(fā)病中或起重要的作用。 第二部分：結(jié)果顯示沉默Id1后,血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖及成血管能力降低,但凋亡增多。而其下游分子HIF-1α、VEGF、iNOS的含量降低,提示干擾Id1之后,導(dǎo)致通路上的因子含量發(fā)生改變,從而導(dǎo)致血管瘤內(nèi)皮細胞增殖、凋亡、成血管能力的改變,誘發(fā)血管瘤的消退。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5

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本文編號：2534853