【摘要】：目的: 惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多種生物活性分子,抑制機體的免疫功能,構(gòu)成腫瘤免疫逃逸的重要機制。阻斷惡性腫瘤細(xì)胞的這種免疫抑制作用,有助于對惡性腫瘤的控制和治療。靈芝多糖( Ganoderma lucidum Polysaccharides Gl-PS)是靈芝的主要活性成分之一,具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。但其是否能夠拮抗惡性腫瘤產(chǎn)生的免疫抑制物對免疫細(xì)胞的抑制作用,還有待直接證據(jù)加以確認(rèn)。本實驗采用福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所從段木栽培的靈芝中分離提取、純化出的靈芝多糖,選擇高轉(zhuǎn)移性的小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞,探討靈芝多糖拮抗腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對淋巴細(xì)胞的抑制作用。 方法: 1.細(xì)胞來源:本實驗采用的B16F10細(xì)胞是一種來源于C57BL/6小鼠的高轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞系,淋巴細(xì)胞為新鮮制備的BALB/C小鼠及C57BL/6小鼠的脾淋巴細(xì)胞。 2.制備B16F10細(xì)胞培養(yǎng)上清(簡稱腫瘤上清):2×104/ml B16F10細(xì)胞,接種于50ml培養(yǎng)瓶,每瓶10ml,培養(yǎng)至細(xì)胞長滿80%時換液,繼續(xù)培養(yǎng)8h,收集培養(yǎng)上清,0.22μm濾紙濾菌,分裝,-20℃凍存?zhèn)溆谩?3.靈芝多糖拮抗腫瘤上清對PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用實驗:取96孔板將C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于腫瘤上清或正常培養(yǎng)基中,1×106細(xì)胞/孔,同時向培養(yǎng)于腫瘤上清中的脾淋巴細(xì)胞加入不同濃度的靈芝多糖,以不加靈芝多糖者為對照,培養(yǎng)72小時,用MTT法檢測細(xì)胞的OD值以判定細(xì)胞的增殖活性。 4.靈芝多糖拮抗腫瘤上清對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用實驗:采用雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。取96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,將等量的1×106細(xì)胞/孔的BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于腫瘤上清或正常培養(yǎng)基中,同時向培養(yǎng)于腫瘤上清中的脾淋巴細(xì)胞加入不同濃度的靈芝多糖,以不加靈芝多糖者為對照,培養(yǎng)72小時,用MTT法檢測細(xì)胞的OD值以判定混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 5.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測靈芝多糖拮抗腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用實驗:C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于腫瘤上清或正常培養(yǎng)基中,1×106細(xì)胞/孔,同時向培養(yǎng)于腫瘤上清中的脾淋巴細(xì)胞加入不同濃度的靈芝多糖,以不加靈芝多糖者為對照,培養(yǎng)72小時,收集未貼壁淋巴細(xì)胞,涂片,進行細(xì)胞免疫化學(xué)染色,顯微鏡觀察結(jié)果,以胞漿染成棕色為陽性。 6.Western blot檢測靈芝多糖拮抗腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用實驗:小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于腫瘤上清或正常培養(yǎng)基中,1×106細(xì)胞/孔,同時向培養(yǎng)于腫瘤上清中的脾淋巴細(xì)胞加入不同濃度的靈芝多糖,以不加靈芝多糖者為對照,培養(yǎng)72小時,收集未貼壁淋巴細(xì)胞,提取蛋白,應(yīng)用Western blot方法測定顆粒酶B及穿孔素的表達。 7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件,對結(jié)果進行單因素方差分析,p0.05表示差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.腫瘤上清對PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用:MTT結(jié)果顯示,在腫瘤上清作用下,PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞OD值為1.132±0.086,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RPMI 1640培養(yǎng)液對照組的1.797±0.075,差異具有高度顯著性(t=16.447,p=000)。 2.腫瘤上清對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用:MTT結(jié)果顯示,在腫瘤上清作用下,混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的的小鼠脾淋巴細(xì)胞OD值為0.825±0.157,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于RPMI 1640培養(yǎng)液對照組的1.334±0.083,差異具有高度顯著性(t=8.097,p=000)。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用:在腫瘤上清作用下,PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性程度遠(yuǎn)低于RPMI 1640培養(yǎng)液對照組。 4.Western blot檢測腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用:在腫瘤上清作用下,PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的相對表達水平分別為0.7662±0.017和0.7857±0.056明顯低于RPMI 1640培養(yǎng)液對照組的1.000,差異有高度顯著性(t=23.698, p=0.002;t=6.658, p=0.003)。 5.靈芝多糖拮抗腫瘤上清對PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用:MTT結(jié)果顯示,在不同濃度靈芝多糖作用下,腫瘤上清作用的PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞OD值分別為1.350±0.068、1.400±0.053、1.455±0.046和1.592±0.049,明顯高于未用靈芝多糖作用的對照組的1.132±0.086,且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。但還均未能達到未受腫瘤上清抑制的RPMI 1640培養(yǎng)基對照的1.796±0.075,經(jīng)方差分析,差異有高度顯著性(F=97.499, p=000);兩兩比較除0.2μg/ml與0.8μg/ml、0.8μg/ml與3.2μg/ml組之間比較差異無顯著性外,各組之間差異均有高度顯著性(p=000)。 6.靈芝多糖拮抗腫瘤上清對混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用: MTT結(jié)果顯示,在腫瘤上清作用下,同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞與異基因小鼠脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)后72h的小鼠脾淋巴細(xì)胞OD值分別為1.170±0.205、1.209±0.125、1.234±0.148和1.247±0.148,明顯高于未用靈芝多糖作用的對照組的0.825±0.157,差異有高度顯著性(F=11.335, p=000)。雖呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢,但兩兩比較分析各劑量組之間除均與未用靈芝多糖作用的對照組差異有高度顯著性(p=000)外,差異均無顯著性(p0.05);各劑量組的結(jié)果均接近未受腫瘤上清抑制的常規(guī)RPMI 1640培養(yǎng)基對照的1.335±0.083,經(jīng)方差分析,差異沒有顯著性(p0.05)。 7.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測靈芝多糖拮抗腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,腫瘤上清對PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達的抑制作用明顯減低或消失,免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性程度明顯高于未經(jīng)靈芝多糖作用的對照組。 8.Western blot檢測靈芝多糖拮抗腫瘤上清對淋巴細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達的抑制作用:在不同濃度靈芝多糖作用下,腫瘤上清對PHA誘導(dǎo)后72h的同基因小鼠脾淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達的抑制作用明顯減低或消失,穿孔素蛋白表達水平分別為1.073±0.040、1.127±0.037、1.240±0.0143和1.352±0.035,明顯高于未用靈芝多糖作用的對照組的1.000,且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,差異有高度顯著性(F=66.256, p=000)。其中高劑量組(3.2μg/ml和12.8μg/ml)已經(jīng)接近未受腫瘤上清抑制的對照組的1.306±0.029,差異沒有顯著性(p0.05)。兩兩比較分析各劑量組與未用靈芝多糖作用的對照組之間差異均有顯著性(p0.05)或高度顯著性(p0.01),除0.2μg/ml與0.8μg/ml之間差異沒有顯著性p0.05)外,其它各劑量組之間差異均有高度顯著性(p0.01)。顆粒酶B蛋白表達水平分別為1.021±0.041、1.089±0.026、1.210±0.079和1.259±0.089,明顯高于未用靈芝多糖作用的對照組的1.000,且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,差異有高度顯著性(F=10.954,p=000)。其中高劑量組(3.2μg/ml和12.8μg/ml)已經(jīng)接近未受腫瘤上清抑制的對照組的1.277±0.090,差異沒有顯著性(p0.05)。兩兩比較分析低劑量組(0.2μg/ml、0.8μg/ml)與未用靈芝多糖作用的對照組之間差異沒有顯著性(p0.05)高劑量組(3.2μg/ml、12.8μg/ml)有高度顯著性(p0.01),各劑量組之間除0.2μg/ml與0.8μg/ml之間、0.8μg/ml與3.2μg/ml之間、0.8μg/ml與12.8μg/ml之間、3.2μg/ml與12.8μg/ml之間差異沒有顯著性(p0.05)外,其它各劑量組之間差異均有顯著性(p0.05)或高度顯著性(p0.01)。 結(jié)論: 1. B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對小鼠脾淋巴細(xì)胞有免疫抑制作用。 2.靈芝多糖可拮抗B16F10黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：2514317