本文關(guān)鍵詞：P16基因沉默及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學(xué)》 2014年

P16基因沉默及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的影響

趙璐  

【摘要】：目的：基因沉默（Gene Silencing)是真核生物細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種手段�；虺聊卸喾N方法，RNA干擾（RNAinterference, RNAi）現(xiàn)象是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，即由內(nèi)源性或外源性同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的目的mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。人毛乳頭細(xì)胞（dermal papilla cells，DPCs）是一簇間充質(zhì)細(xì)胞位于毛囊基底部，也是一種特化的成纖維細(xì)胞，其對(duì)毛囊的誘導(dǎo)和分化有重要作用。研究表明毛乳頭細(xì)胞這種作用與其在體內(nèi)外成特征性凝集性生長(zhǎng)有密切的關(guān)系，體外實(shí)驗(yàn)證明，毛乳頭細(xì)胞會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸失去其凝集性生長(zhǎng)的特性，細(xì)胞傳代至7、8、9代時(shí)這種特征性的凝集性生長(zhǎng)基本消失，隨著此特性消失，毛乳頭細(xì)胞對(duì)毛囊形態(tài)學(xué)的影響及生長(zhǎng)周期的調(diào)控作用也逐漸消失，從而導(dǎo)致了斑禿等毛發(fā)疾病的發(fā)生。P16基因?yàn)榧?xì)胞周期調(diào)控因子，其主要通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白激酶4（cyclindependent kinase,CDK4）而發(fā)揮作用，主要功能使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期受阻，從而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，高傳代的毛乳頭細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)量較低傳代的毛乳頭細(xì)胞中高，P16基因可能與細(xì)胞衰老有關(guān)。毛乳頭細(xì)胞高傳代時(shí)失去其特征性的凝集性生長(zhǎng)，細(xì)胞周期延長(zhǎng)，P16蛋白表達(dá)量增加，考慮將將P16基因沉默后，毛乳頭細(xì)胞能否延遲衰老，或恢復(fù)其特征性凝集性生長(zhǎng)，從而恢復(fù)對(duì)毛囊的調(diào)控作用，為毛發(fā)疾病，特別是斑禿的治療提供新的方法？ 方法： 1實(shí)驗(yàn)分組 將購(gòu)得的人毛乳頭細(xì)胞隨機(jī)分為三組，分別為基因沉默組、陰性對(duì)照組和正常組。 2人毛乳頭細(xì)胞的RNA干擾。 將復(fù)蘇后的毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)于專用MSCM培養(yǎng)基中，并置于37℃、適宜濕度、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)60％-70％后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，于基因沉默組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中分別加入含有適量的病毒顆粒的無(wú)血清培養(yǎng)基，4小時(shí)后，更換為MSCM培養(yǎng)基，待溫箱內(nèi)放置48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下觀察人毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。 3倒置相差顯微及電鏡下觀察，，不同組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)的不同。 4MTT法測(cè)不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 5PCR方法檢測(cè)不同組細(xì)胞P16基因mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參照為甘油醛-3磷酸脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）。 6用免疫熒光法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組細(xì)胞的P16蛋白的表達(dá)異。 7流式細(xì)胞儀測(cè)定基因沉默后不同組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡。 8運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和處理。 結(jié)果： 1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大約為70%-80%，符合實(shí)驗(yàn)要求（Fig.2-2）。 2倒置相差顯微鏡及電鏡下觀察，P16基因沉默組及陰性對(duì)照組較正常組有較多的核分裂，及細(xì)胞表面的顆粒樣物質(zhì)（Fig.2-3、Fig.2-4）。 3MTT法測(cè)定不同時(shí)間不同組細(xì)胞吸光度值改變，從而繪制出各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果（Fig.2-5、Table2-3）正常組第1-5天的吸光度分別為0.196±0.030、0.266±0.048、0、325±0.027、0.369±0.045、0.465±0.057；陰性對(duì)照組為0.164±0.039、0.283±0.063、0.314±0.064、0.406±0.075、0.437±0.070；基因沉默組為0.206±0.047、0.253±0.033、0.359±0.081、0.519±0.079、0.536±0.052。 4普通PCR結(jié)果顯示內(nèi)參照組的亮度基本相同，實(shí)驗(yàn)組基因沉默組的亮度明顯暗于陰性對(duì)照組和基因沉默組（Fig.2-7），Q-PCR結(jié)果顯示表示P16基因mRNA的含量的RQ值基因沉默組為0.04±0.007；陰性對(duì)照組為0.66±0.356；正常組為1（Fig.2-8、Table2-2）。 5免疫熒光法測(cè)定不同組細(xì)胞P16蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示基因沉默組熒光量最弱，陰性對(duì)照組熒光量與正常組熒光量比基因沉默組強(qiáng)（Fig.2-10）。 6流式細(xì)胞儀測(cè)定3組細(xì)胞P16蛋白表達(dá)量結(jié)果為，所得到的FI值基因沉默組4代細(xì)胞為2.43±0.02,8代細(xì)胞為2.04±0.06；陰性對(duì)照組4代細(xì)胞為2.25±0.03,8代細(xì)胞為1.91±0.07；基因沉默組4代細(xì)胞為1.27±0.31,8代細(xì)胞為1.2±0.05（Fig.2-10、Table2-4）。 7流式細(xì)胞儀測(cè)定3組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率，測(cè)定細(xì)胞凋亡率結(jié)果為基因沉默組為8.92±0.61，陰性對(duì)照組為4.35±0.05，正常組為2.86±0.07；測(cè)定細(xì)胞周期時(shí)G1%基因沉默組為57.8±4.38，陰性對(duì)照組為68±1.27，正常組為82.1±0.99；S%含量基因沉默組為45.1±1.27；陰性對(duì)照組為26.7±0.71，正常組為8.6±4.45（Fig.2-11、Table2-5）。 結(jié)論： 1P16基因可能通過(guò)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。 2P16基因可能與細(xì)胞的衰老有關(guān)。 3可以通過(guò)調(diào)節(jié)人毛乳頭細(xì)胞P16基因的表達(dá)量，為斑禿的患者提供一種新的治療方法。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

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3 邱慶明;若干生精細(xì)胞相關(guān)基因功能初步研究[D];中南大學(xué);2009年

4 陳婷;果蠅中染色體乙�；c去乙�；揎椉捌渑c熱休克基因表達(dá)的關(guān)系[D];東北師范大學(xué);2002年

5 申彥森;基于內(nèi)含子剪切的人工miRNA結(jié)構(gòu)和靶向位點(diǎn)與基因沉默效率的關(guān)系研究[D];武漢大學(xué);2009年

6 姜國(guó)勇;番茄Tm-2～2基因在煙草中的表達(dá)及其編碼蛋白特異氨基酸決定對(duì)病毒的抗性[D];福建農(nóng)林大學(xué);2003年

7 劉春艷;組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP/p300對(duì)人白細(xì)胞介素-5基因表達(dá)調(diào)控的影響及其分子機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2004年

8 麻鵬達(dá);基因沉默抑制子P1/HC-Pro和P25在瞬時(shí)體系中的作用[D];東北師范大學(xué);2007年

9 范維;脫氧胞苷激酶基因沉默對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞遷移和侵襲功能的影響[D];上海交通大學(xué);2013年

10 柴春利;家蠶胚胎發(fā)育相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能研究[D];西南大學(xué);2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孔令廣;反向重復(fù)結(jié)構(gòu)不同位置側(cè)翼序列誘導(dǎo)的基因沉默差異比較[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 鄭璐平;番茄抗葉霉菌相關(guān)基因的鑒定及TRV 16K基因的功能分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2007年

3 耿文君;東亞三角渦蟲(chóng)DjSparc-like基因的進(jìn)化、表達(dá)以及功能分析[D];山東理工大學(xué);2009年

4 成磊;miRNA介導(dǎo)靶基因沉默的分析與識(shí)別[D];南京航空航天大學(xué);2011年

5 李志清;家蠶BmMet基因的鑒定、克隆及功能分析[D];西南大學(xué);2009年

6 鞏校東;比較分析大腸桿菌K-12中的必要基因與非必要基因[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

7 施偉;基于黃瓜花葉病毒的基因沉默載體優(yōu)化[D];浙江理工大學(xué);2012年

8 聶敏;東亞三角渦蟲(chóng)DjRhoA基因的表達(dá)及功能分析[D];山東理工大學(xué);2011年

9 彭麗娜;家蠶BmDichaete基因的克隆及功能初探[D];西南大學(xué);2012年

10 呂坤;棉花病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系的建立及其在棉花抗黃萎病中的應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：P16基因沉默及對(duì)人毛乳頭細(xì)胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：250353