【摘要】：目的 黑色素瘤是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤,其高度侵襲轉(zhuǎn)移性和對于傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性被認為是黑色素瘤治療和預(yù)后的最大障礙。RhoC作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子可通過多種轉(zhuǎn)移相關(guān)機制參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移,是控制腫瘤轉(zhuǎn)移的分子開關(guān),RhoC有望成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶位。RNAi技術(shù)是目前公認快速有效的基因沉默方式,有利于進行基因治療和表達缺失下的功能研究。 目前多項研究證實RNAi技術(shù)可通過調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因表達進而調(diào)控細胞的各種生命活動,但應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建、RhoC基因沉默對黑色素瘤生物學(xué)行為,尤其是侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響以及對化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)性的研究尚未見報道。本研究擬利用RNAi技術(shù),以慢病毒作為基因載體,以人黑色素瘤A375細胞作為研究對象,以轉(zhuǎn)移相關(guān)基因RhoC作為靶基因,研究靶向RhoC基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建及沉默RhoC基因?qū)w外培養(yǎng)A375細胞生物學(xué)行為包括細胞增殖、細胞凋亡、細胞粘附能力、細胞侵襲能力的影響；腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、上皮鈣粘附素(E-cadherin)的表達水平的變化；以及對于治療黑色素瘤的化療藥物氮烯咪胺(Dacarbazine, DTIC)耐藥性的逆轉(zhuǎn)并分析其可能機制,旨在探討RhoC基因在黑色素瘤細胞生物學(xué)行為中的作用,為RhoC作為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因治療靶位的可行性、為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥及基因治療提供實驗室依據(jù),為進一步應(yīng)用RNAi技術(shù)治療腫瘤提供新的思路。 方法 1根據(jù)RhoC編碼區(qū)基因信息設(shè)計構(gòu)建三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體,并轉(zhuǎn)染人黑色素瘤A375細胞,應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測三對pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體對A375細胞RhoC mRNA及蛋白表達的沉默效應(yīng)從而篩選出最有效的靶序列。 2將RNAi效應(yīng)最佳的序列進一步構(gòu)建至pcDNA6.2-EmGFP-miR中并進行慢病毒包裝構(gòu)建形成靶向RhoC pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體,測序并感染A375細胞,進一步應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測對RhoC mRNA及蛋白表達的沉默效應(yīng)。 3體外實驗中,將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體感染人黑色素瘤A375細胞,應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2, E-cadherin mRNA及蛋白表達：應(yīng)用Transwell小室細胞侵襲實驗檢測A375細胞侵襲能力；應(yīng)用細胞粘附實驗檢測對層粘連蛋白和纖維粘連蛋白的粘附能力；應(yīng)用MTT法檢測細胞增殖；應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡：應(yīng)用MTT法檢測對化療藥物氮烯咪胺(DTIC)耐藥性的逆轉(zhuǎn)率。同時應(yīng)用上述各種方法對對照組相應(yīng)指標(biāo)進行檢測。 統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。多樣本均數(shù)比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD比較或Dunnett T3比較。以p0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1構(gòu)建的三對shRNA表達載體分別為pGPU6/GFP/Neo-shRNA336、pGPU6/GFP/Neo-shRNA453及pGPU6/GFP/Neo-shRNA680,應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染人黑色素瘤A375細胞后靶基因RhoC mRNA和蛋白表達水平分別為1.47±0.26、1.13±0.16、1.39±0.11和70.98±9.21、50.67±6.06、65.77±4.06,pGPU6/GFP/Neo-shRNA453為最有效干擾序列。 2成功構(gòu)建了靶向RhoC的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體,經(jīng)測序證實序列正確；將構(gòu)建的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體感染人黑色素瘤A375細胞,應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC mRNA和蛋白的表達水平分別為1.05±0.05、62.04±15.86,而陰性對照慢病毒組、正常對照組RhoC mRNA和蛋白分別為4.21±0.24、220.86±24.07和4.63±0.32、257.39±12.30,慢病毒表達載體組較對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 3體外實驗中,將pLenti6.3-EGFP-453慢病毒載體感染人黑色素瘤A375細胞,應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測RhoC基因沉默后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2 mRNA和蛋白的表達水平分別為1.17±0.16,66.40±14.51；而陰性對照慢病毒組、正常對照組MMP-2 mRNA和蛋白分別為2.28±0.31、112.59±23.27；2.75±0.90、135.88±26.16; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。應(yīng)用熒光定量PCR和Western blot檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組E-cadherin mRNA和蛋白的表達水平分別為2.95±0.71、125.17±19.88；而陰性對照慢病毒組、正常對照組E-cadherin mRNA和蛋白的表達水平分別為1.80±0.47、77.39±13.38; 0.97±0.54、47.91±18.69; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4體外實驗中,Transwell小室細胞侵襲實驗結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組穿膜細胞數(shù)為40.41±8.88,較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；陰性對照慢病毒組穿膜細胞數(shù)為64.82±13.48,正常對照組為77.46±6.47,陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)晶紫染色法細胞粘附實驗結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組A375細胞對層粘連蛋白(Ln)和纖維粘連蛋白(Fn)的粘附能力較慢病毒陰性對照組、正常細胞對照組明顯下降,通過酶標(biāo)儀測定光密度OD值,pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.467+0.005、0.321±0.007,較陰性對照慢病毒組、正常對照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；陰性對照慢病毒組對Ln和Fn的OD值分別為0.532±0.005、0.376±0.004,正常細胞組分別為0.5444±0.008、0.381±0.007,陰性對照慢病毒組較正常對照組輕微下降,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 5體外實驗中,MTT法檢測細胞增殖結(jié)果顯示：24h時間點pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度為0.319±±0.004,與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。72h、120h及168h時間點時,pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組吸光度分別為0.337±±0.004、0.369±±0.004和0.397±±0.005；而陰性對照慢病毒組、正常對照組吸光度分別為0.350±±0.001、0.389±±0.002、0.425±±0.006和0.355±0.003、0.404±0.005、0.440±0.010; pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組的細胞增殖較兩對照組下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 MTT法檢測pLenti6.3-EGFP-453慢病毒感染人黑色素瘤A375細胞后對DTIC耐藥性影響結(jié)果顯示：DTIC終濃度為0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml時,慢病毒表達載體聯(lián)合藥物組抑制率分別為8.82%、14.01%、23.15%和33.51%；單獨藥物組抑制率分別為1.97%、7.79%、13.57%和20.37%,在單獨使用不同藥物濃度DTIC作用下,IC50值為254.99μg/ml,而聯(lián)合應(yīng)用pLenti6.3-EGFP-453慢病毒和藥物DTIC作用下,IC50值下降為162.41μg/ml,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.57倍。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示：pLenti6.3-EGFP-453慢病毒組細胞凋亡率為13.36±±0.39%,與陰性對照慢病毒組、正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陰性對照慢病毒組細胞凋亡率為4.78±±0.45%,正常對照組為3.98±±0.41%,兩對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1成功構(gòu)建的靶向RhoC基因的pLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體可高效感染體外培養(yǎng)的人黑色素瘤A375細胞,并可顯著抑制靶基因RhoC mRNA和蛋白的表達。 2 PLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體RhoC基因沉默后,可明顯下調(diào)體外培養(yǎng)的人黑色素瘤A375細胞的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2表達,上調(diào)E-cadherin的表達。腫瘤細胞侵襲和粘附能力明顯抑制。RhoC基因沉默可能通過對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達調(diào)控來實現(xiàn)對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。 3 PLenti6.3-EGFP-453慢病毒表達載體RhoC基因沉默后,人黑色素瘤A375細胞增殖抑制,細胞凋亡增加,并可逆轉(zhuǎn)A375細胞對化療藥物DTIC的耐藥性。RNAi技術(shù)可提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,誘導(dǎo)細胞凋亡可能是其途徑之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

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本文編號：2490571