發(fā)布時(shí)間：2019-03-29 12:21

【摘要】：目的 :探討磷脂酰肌醇4,5-二磷酸5磷酸酶A(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 5-phosphatase A,PIB5PA)對(duì)人黑素瘤Mel-FH細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。方法 :構(gòu)建攜帶4-羥基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的重組真核表達(dá)載體pF-5xUAS-SV40-PIB5PA,并將其感染人黑素瘤Mel-FH細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素和潮霉素B的雙重篩選,成功獲得穩(wěn)定感染的Mel-FH.PIB5PA亞克隆細(xì)胞。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)4-OHT誘導(dǎo)Mel-FH.PIB5PA細(xì)胞表達(dá)PIB5PA蛋白的最佳濃度和最適時(shí)間,應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)Mel-FH.PIB5PA細(xì)胞的遷移和侵襲能力,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Mel-FH.PIB5PA細(xì)胞中磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinase B,p-PKB,又稱p-AKT)、磷酸化黏著斑激酶(phospho-focal adhesion kinase,p-FAK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)和TIMP-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 :10 nmol/L 4-OHT處理黑素瘤MelFH.PIB5PA細(xì)胞16 h后可穩(wěn)定誘導(dǎo)PIB5PA蛋白過(guò)表達(dá)。與未經(jīng)4-OHT處理的Mel-FH.PIB5PA細(xì)胞比較,誘導(dǎo)PIB5PA過(guò)表達(dá)能顯著抑制Mel-FH.PIB5PA細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P0.05),并下調(diào)p-AKT、p-FAK、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1蛋白的表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論 :外源性過(guò)表達(dá)PIB5PA可明顯抑制人黑素瘤Mel-FH細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力,其機(jī)制可能與蛋白激酶AKT和FAK的活性下調(diào),從而下調(diào)MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1的相對(duì)表達(dá)水平有關(guān)。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of phosphatidylinositol 4,5-diphosphate 5-phosphatase A (phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 5-phosphatase A, PIB5PA on migration and invasion of human melanoma Mel-FH cells. Methods: the recombinant eukaryotic expression vector pF-5xUAS-SV40-PIB5PA, carrying 4-hydroxytamoxifen (4-hydroxytamoxifen)-regulated gene expression system was constructed and infected with human melanoma Mel-FH cells. Stable Mel-FH.PIB5PA subclone cells were successfully obtained by double screening of puromycin and hygromycin B. The optimal concentration and time of expression of PIB5PA protein in Mel-FH.PIB5PA cells induced by 4-OHT were detected by Western blot. The migration and invasion ability of Mel-FH.PIB5PA cells were detected by cell scratch test and Transwell chamber assay. Western blot assay was used to detect phosphorylated protein kinase B (phospho-protein kinase B), phosphorylated focal adhesion kinase (phospho-focal adhesion kinase,p-FAK), matrix metalloproteinases-2 (matrix metalloproteinase-2,) in Mel-FH.PIB5PA cells. Expression of MMP-2, MMP-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1 (TIMP-1) and TIMP-2 protein. Results: the overexpression of PIB5PA protein was stably induced in melanoma MelFH.PIB5PA cells treated with 10 nmol/L 4-OHT for 16 h. Compared with non-4-OHT-treated Mel-FH.PIB5PA cells, the over-expression of PIB5PA significantly inhibited the migration and invasion ability of Mel-FH.PIB5PA cells (P0.05), and down-regulated the migration and invasiveness of Mel-FH.PIB5PA cells (P < 0.05), and down-regulated the expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1. Expression level of TIMP-2,MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 protein (P0.05). Conclusion: exogenous overexpression of PIB5PA can significantly inhibit the migration and invasion of human melanoma Mel-FH cells in vitro, and its mechanism may be related to the down-regulation of protein kinase AKT and FAK activities. Thus, the relative expression level of MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 was down-regulated.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室;澳大利亞紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)腫瘤與免疫實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81301738)
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2449540