【摘要】：須癬毛癬菌也稱石膏樣毛癬菌,是一種常見的親人、親動物性皮膚癬菌,不僅可以引起皮膚、指甲等部位的淺部感染,還可以引起膿癬、膿腫和肉芽腫等皮膚深部感染。須癬毛癬菌引起的皮膚深部感染比較少見,而且難以治愈,易復(fù)發(fā)和再感染。目前對須癬毛癬菌致淺部感染的發(fā)病機(jī)制有了一些研究,大多數(shù)研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平上,而對須癬毛癬菌致深部感染的發(fā)病機(jī)制研究甚少。 皮膚主要由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成,表皮分為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和基底層;真皮分為乳頭層和網(wǎng)狀層。表皮主要由細(xì)胞構(gòu)成;真皮主要由連結(jié)性纖維組織、骨膠原及彈性纖維構(gòu)成。須癬毛癬菌引起淺部感染局限在表皮層內(nèi),而皮膚癬菌引起的深部感染已穿透表皮層至真皮及皮下組織,同一種菌引起感染部位及病變程度的差異是否存在不同的致病因子,本研究將進(jìn)一步探討。本文以須癬毛癬菌為研究對象,從生物學(xué)特征-基因型-蛋白質(zhì)水平探討肉芽腫株和體癬株間的差異,試圖尋找更為強(qiáng)的毒力因子,以指導(dǎo)臨床用藥。 目的:篩選肉芽腫株和體癬株的差異表達(dá)蛋白,探討須癬毛癬菌致深部和淺部感染的發(fā)病機(jī)制。 方法: 1.菌培養(yǎng):對須癬毛癬菌的4株肉芽腫株和4株體癬株進(jìn)行27℃和37℃平皿培養(yǎng)、鋼圈法小培養(yǎng),觀察菌落生長形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)。 2.豚鼠感染實(shí)驗(yàn):制備4株肉芽腫株和4株體癬株菌懸液,糖皮質(zhì)激素免疫干預(yù)后,行皮膚表面和皮下兩種接種方式接種等量菌懸液,觀察皮損。對皮損直接鏡檢、真菌培養(yǎng)和組織病理驗(yàn)證感染結(jié)果。豚鼠正常皮膚為陰性對照。 3. PCR擴(kuò)增:對13株肉芽腫株和體癬株的NTS區(qū)(非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))及其內(nèi)的三個亞區(qū)Tmis0區(qū)、Tmis1區(qū)、Tmis2區(qū)行PCR擴(kuò)增。 4.比較蛋白質(zhì)組學(xué):選取肉芽腫株和體癬株各一株行雙向電泳、考馬斯亮藍(lán)染色,Pdquest8.0軟件分析,摳取相關(guān)的差異蛋白凝膠點(diǎn),進(jìn)行質(zhì)譜檢測,獲取的蛋白質(zhì)的相關(guān)信息,通過NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定分析。 結(jié)果: 1.菌落形態(tài):37℃,4株肉芽腫株均優(yōu)于4株體癬株生長;27℃兩者生長差別不明顯;4株肉芽腫株在37℃優(yōu)于27℃生長;4株體癬株在27℃優(yōu)于37℃生長(見圖1)。 2.顯微鏡下形態(tài):37℃:4株肉芽腫株菌絲完整飽滿,較多小分生孢子,及少量大分生孢子,4株體癬株出現(xiàn)菌絲干枯萎縮,斷裂現(xiàn)象;27℃:4株肉芽腫株和4株體癬株差別不明顯(見圖2)。 3.豚鼠感染模型: 3.1體癬模型: 4株肉芽腫株:第2天皮膚表面出現(xiàn)紅斑,范圍逐漸擴(kuò)大,兩周后紅斑表面覆以厚層鱗屑,3周后兩株菌株出現(xiàn)糜爛,破潰,表面毛發(fā)出現(xiàn)斷裂;4株體癬株:第4天出現(xiàn)淡紅斑,隨后皮損表面覆有薄層鱗屑,未見糜爛、破潰。4周后4株肉芽腫株和4株體癬株逐漸趨于好轉(zhuǎn)。 3.2肉芽腫模型:肉芽腫株:第5天后于注射部位出現(xiàn)黃豆大小結(jié)節(jié),質(zhì)實(shí),逐漸增大,2周后至指甲大小;體癬株:未見結(jié)節(jié)出現(xiàn)。 3.3組織病理:第3周對肉芽腫結(jié)節(jié)行病理、PAS染色示肉芽腫性炎性改變(見圖4a),分隔菌絲和串珠樣孢子(見圖4b、c)。 3.4真菌鏡檢及培養(yǎng):切取組織培養(yǎng),2周后見絨毛狀菌落(見圖5a、b),挑取菌落鏡檢見大量菌絲(見圖5c)。 4. PCR擴(kuò)增: 3個亞區(qū)均呈現(xiàn)出不同的帶型(見圖6),其中TmiS0區(qū)分為4型,TmiS1區(qū)分為5型,TmiS2區(qū)分為2型。 5.蛋白雙向電泳及PDquest軟件分析:肉芽腫株檢測到蛋白質(zhì)點(diǎn)463±20個,體癬株檢測到蛋白質(zhì)點(diǎn)398±17個;兩者差異蛋白100余個,肉芽腫株高表達(dá)的62個左右。 結(jié)論: 1.肉芽腫株、體癬株生物學(xué)性狀有一定差異,肉芽腫株較體癬株耐熱。 2.肉芽腫株與體癬株至豚鼠致病不同,肉芽腫株較體癬株易感染宿主,且炎癥反應(yīng)明顯。 3.肉芽腫株與體癬株的基因型無差別。 4.肉芽腫株和體癬株蛋白質(zhì)水平有明顯差異,獲得肉芽腫株有意義的蛋白包括烯醇化酶、熱休克蛋白70,60及小分子熱休克蛋白、絲-蘇氨酸蛋白酶、NADH的氧化還原酶輔酶、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白、能量相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及一些假想蛋白。 5.肉芽腫株和體癬株生物學(xué)特征和蛋白質(zhì)的功能有一定的差異,而基因型無明顯差異。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R756

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2446471