【摘要】：目的:黑素瘤(melanoma)是目前位于首位的致死性皮膚腫瘤,其發(fā)病率呈急速上升趨勢(shì),大多見(jiàn)于30歲以上的成年人,可發(fā)生于皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官。它是由于遺傳因素、環(huán)境因素及其共同影響而引起的一種腫瘤,惡性程度極高,早期即可發(fā)生血液及淋巴道轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)移又是造成患者死亡的主要原因。隨著近代醫(yī)學(xué)分子水平的不斷發(fā)展,人們更加希望通過(guò)精準(zhǔn)化的治療提高黑素瘤的治愈率及延長(zhǎng)患者的生存期。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是調(diào)節(jié)血管生的最重要的細(xì)胞因子之一,尤其是對(duì)腫瘤的新生血管的調(diào)節(jié)及對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的影響非常明顯。實(shí)體腫瘤內(nèi)新生血管的形成是其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲的重要結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)供需的基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子主要通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)受體即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)特異性結(jié)合,激活下游通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管生成。在人類(lèi)多種腫瘤中相繼發(fā)現(xiàn):不僅腫瘤血管內(nèi)皮的細(xì)胞可以表達(dá)VEGF受體,腫瘤細(xì)胞中也有VEGF受體的表達(dá),而這也是腫瘤細(xì)胞中VEGF自分泌機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。VEGFR目前發(fā)現(xiàn)有3種:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,VEGFR-2是最主要的功能受體,可與VEGF-A、C、D結(jié)合。VEGFR-2是最主要的功能受體,其與VEGF結(jié)合后可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列變化,促進(jìn)腫瘤組織的血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。越來(lái)越多的研究表明,VEGF及其受體在多種腫瘤中的表達(dá)含量增高:有數(shù)據(jù)顯示在肺癌組織中VEGF及VEGFR2高表達(dá)并且與肺癌組織有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及腫瘤的分化程度密切相關(guān),提示VEGF及VEGFR2在肺癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用;也有研究不斷發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體VEGFR2不但表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,在卵巢癌細(xì)胞中也存在高表達(dá);在大腸癌患者研究中發(fā)現(xiàn)VEGFR2可促進(jìn)大腸腺癌的侵襲、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,并且vegfr2高表達(dá)的大腸癌患者預(yù)后不良。先前研究表明黑素瘤細(xì)胞高表達(dá)vegf并且高表達(dá)的vegf與黑素瘤發(fā)病及預(yù)后關(guān)系密切。而tas等人研究證實(shí)黑素瘤患者血漿中vegf水平明顯升高,且vegf的表達(dá)水平與疾病發(fā)展階段相關(guān)。人們?cè)絹?lái)越重視腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用,而抑制vegf,減少血管生成,切斷腫瘤血供也成為治療腫瘤的研究熱點(diǎn)。靈芝屬多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體,是一種非常珍貴的藥食兩用菌類(lèi),具有很高的醫(yī)療及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,靈芝在中國(guó)已有幾千年的藥用歷史,藥物療效與食用方法相關(guān)。服用后對(duì)身體有很多補(bǔ)益作用,可治療神經(jīng)衰弱、心律失常、高血壓,補(bǔ)氣活血安神,也可以防治慢性支氣管炎等疾病。靈芝多糖(ganodermalucidumpolysaeeharides,gl-ps)是從靈芝中提取的其中的主要藥效成分之一,具有增強(qiáng)免疫、抗機(jī)體氧化、降血糖及抗糖尿病并發(fā)癥等作用。大量臨床研究表明,靈芝多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能間接地抑制了腫瘤細(xì)胞的增生,也有研究顯示靈芝多糖甚至能直接殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究采用不同的濃度gl-ps作用于b16f10黑素瘤細(xì)胞,觀察gl-ps對(duì)b16f10細(xì)胞分泌vegf及其受體vegfr2表達(dá)含量的影響,從而為黑素瘤的治療提供新的方向。方法:1.細(xì)胞來(lái)源:本實(shí)驗(yàn)中使用的黑素瘤b16f10細(xì)胞來(lái)源于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。2.實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):根據(jù)培養(yǎng)基中含有的靈芝多糖的濃度進(jìn)行分組,具體分為0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml共五個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以?xún)H添加rpmi-1640的完全培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組。3.采用realtimepcr(qrt-pcr)逆轉(zhuǎn)錄技術(shù),檢測(cè)vegf及vegfr2在不同濃度gl-ps處理后的b16f10細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)。4.采用蛋白印跡(western-blot)技術(shù),檢測(cè)vegf及vegfr2在不同濃度gl-ps處理后的b16f10細(xì)胞中蛋白水平的差異表達(dá)。5.采用免疫組化(immunohistochemistry)方法檢測(cè)在不同濃度gl-ps處理后的各組b16f10細(xì)胞中vegf及vegfr2的表達(dá)差異。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用spss21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,當(dāng)p值小于0.05時(shí),表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.實(shí)驗(yàn)從基因水平檢測(cè)GL-PS對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的抑制作用:在不同濃度GL-PS作用下,常規(guī)培養(yǎng)B16F10黑素瘤細(xì)胞至匯合狀態(tài),采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示:用GL-PS處理B16F10后,VEGF的基因表達(dá)水平分別為:1.28±0.16,1.13±0.09,0.97±0.08,0.88±0.06,0.75±0.14;VEGFR2的基因表達(dá)水平分別為:1.01±0.06,1.11±0.09,0.8±0.059,0.71±0.03,0.43±0.02;隨著GL-PS濃度的不斷增高,B16F10細(xì)胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表達(dá)呈降低趨勢(shì),經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性((VEGF:F=7.006,P0.05;VEGFR2:F=48.033,P0.005)。2.實(shí)驗(yàn)從蛋白水平檢測(cè)GL-PS對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體的抑制作用:在不同GL-PS作用下,采用western-blot技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示:用GL-PS處理B16F10后,VEGF的蛋白表達(dá)水平分別為:1.63±0.47,1.77±0.16,0.74±0.07,0.82±0.07,0.41±0.10;VEGFR2的蛋白表達(dá)水平分別為:2.16±0.11,1.97±0.07,1.51±0.06,1.35±0.09,1.04±0.16;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著GL-PS濃度的不斷增高,B16F10細(xì)胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表達(dá)呈降低趨勢(shì),經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(VEGF:F=19.931,P0.005;VEGFR2:F=57.155,P0.005)。3.采用免疫組化法進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度GL-PS處理下VEGF及VEGFR2的表達(dá)。對(duì)照組B16F10黑素瘤細(xì)胞VEGF及VEGFR2的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色,而用GL-PS處理后的實(shí)驗(yàn)組B16F10中VEGF及VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)低于對(duì)照組,并且結(jié)果呈現(xiàn)隨濃度的增高而降低趨勢(shì)。結(jié)論:1.靈芝多糖能夠抑制小鼠黑素瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2427914