【摘要】：惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是皮膚腫瘤中惡性程度最高的。近年來(lái)，MM在西方國(guó)家的發(fā)病率逐年升高，我國(guó)MM的發(fā)病率雖然相對(duì)較低，但人口基數(shù)大，其絕對(duì)發(fā)病人數(shù)超過(guò)全世界發(fā)病率最高的澳大利亞。MM除進(jìn)展快、惡性程度高外，還具有轉(zhuǎn)移早而廣泛的特點(diǎn)，常規(guī)放療和化療效果均不佳。因此，深入探討相關(guān)分子在MM轉(zhuǎn)移中的作用，進(jìn)一步揭示MM的轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)MM的臨床治療將具有重要意義。 肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver，PRLs)是新近鑒定的PTP酶家族成員，包括PRL-1、PRL-2和PRL-3三個(gè)成員。其中最早被發(fā)現(xiàn)的是PRL-1，之后通過(guò)分析鼠EST數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)和鑒定了與PRL-1具有同源性的鼠PRL-3；2001年，Matter等從人的肥厚性心肌所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中克隆獲得了人的PRL-3基因。 PRL-3與腫瘤的相關(guān)性最早出現(xiàn)于結(jié)腸癌的研究中，2001年，Saha等比較分析了正常直腸上皮細(xì)胞、直腸原發(fā)癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)移到肝臟的直腸癌細(xì)胞之間PRL-3表達(dá)的差異。結(jié)果表明，PRL-3基因在正常細(xì)胞與原發(fā)癌細(xì)胞中的表達(dá)均處于較低水平，在惡性程度較高的癌細(xì)胞中有中等水平的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平非常高，并且這一結(jié)果在檢測(cè)的所有病例中呈現(xiàn)出高度的一致性，提示PRL-3與直腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Saha等的研究首次揭示了PRL-3與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，此后關(guān)于PRL-3在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中的表達(dá)及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中的作用的研究不斷增多，例如先后發(fā)現(xiàn)PRL-3在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌組織中高表達(dá)，這種高表達(dá)與腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，通過(guò)siRNA干擾技術(shù)抑制PRL-3的表達(dá)，可明顯降低多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而轉(zhuǎn)染PRL-3使其高表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)。這些結(jié)果均表明PRL-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。 最近的研究表明，在中、高轉(zhuǎn)移性的MM細(xì)胞株B16-BL6中，PRL-3的表達(dá)水平明顯高于低轉(zhuǎn)移MM細(xì)胞株B16。將PRL-3轉(zhuǎn)染到B16細(xì)胞后，其遷徙和浸潤(rùn)能力及伸展速度明顯提高，尾靜脈注射給裸鼠后，轉(zhuǎn)染了PRL-3的B16細(xì)胞組能形成更大和更多的肝、肺MM轉(zhuǎn)移灶。這一研究激起了我們深入探索PRL-3在MM侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用的興趣。 主要實(shí)驗(yàn)方法： 1）取皮內(nèi)痣、原位黑素瘤、浸潤(rùn)性黑素瘤、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑素瘤和黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，免疫組化分析PRL-3蛋白的表達(dá)水平； 2） RT-PCR分析5個(gè)MM細(xì)胞系WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG中PRL-3mRNA的表達(dá)水平，Western blot分析PRL-3蛋白表達(dá)水平； 3）選擇PRL-3低表達(dá)的惡性黑素瘤WM793B細(xì)胞和PRL-3高表達(dá)的惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)分析兩種細(xì)胞的體外侵襲能力，裸鼠皮下和尾靜脈分別注射兩種細(xì)胞，分析裸鼠體內(nèi)MM的形成和轉(zhuǎn)移； 4）選擇PRL-3高表達(dá)的惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞，siRNA轉(zhuǎn)染，RT-PCR分析siRNA轉(zhuǎn)染后PRL-3mRNA的表達(dá)水平，Western blot分析siRNA轉(zhuǎn)染后PRL-3蛋白表達(dá)水平； 5）siRNA轉(zhuǎn)染抑制惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞PRL-3的表達(dá)后，光鏡下觀察451Lu細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT法分析siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)451Lu細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀分析siRNA轉(zhuǎn)染451Lu細(xì)胞的凋亡率，分別用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分析siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞遷移能力和體外侵襲能力的影響； 6）依據(jù)PRL-3的siRNA序列構(gòu)建干涉PRL-3的慢病毒shRNA載體�？瞻讓�(duì)照組裸鼠皮下接種未經(jīng)任何處理的黑素瘤細(xì)胞，空載體組裸鼠皮下接種僅以病毒空載體感染的黑素瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下接種慢病毒shRNA感染的黑素瘤細(xì)胞，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，每3天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)和寬，計(jì)算腫瘤體積； 7）裸鼠尾靜脈注射黑素瘤451Lu細(xì)胞(對(duì)照組)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu細(xì)胞，，3周后小鼠脫頸處死，切取肝臟、肺臟，肉眼觀察各組小鼠肝臟、肺表面轉(zhuǎn)移腫瘤數(shù)量，觀察腫瘤成瘤情況及肝、肺轉(zhuǎn)移情況。 主要研究結(jié)果和結(jié)論： 免疫組化結(jié)果顯示在不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性黑素瘤中，PRL-3的陽(yáng)性率明顯高于皮內(nèi)痣(P 0.01)，而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑素瘤組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PRL-3的陽(yáng)性率明顯高于原位黑素瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.01)；同時(shí)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黑素瘤組織(P 0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(P 0.01)中，PRL-3的表達(dá)陽(yáng)性率也明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性黑素瘤。這些結(jié)果表明，MM發(fā)生過(guò)程中PRL-3蛋白的表達(dá)增加，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，PRL-3的表達(dá)水平會(huì)大幅度增加，說(shuō)明PRL-3可能參與了MM轉(zhuǎn)移的過(guò)程。分別用RT-PCR和Western blot分析WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG5個(gè)黑素瘤細(xì)胞系PRL-3mRNA和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)WM793B和C32TG細(xì)胞系中PRL-3表達(dá)水平較低，WM-266-4細(xì)胞系表達(dá)略高，而1205Lu和451Lu細(xì)胞系尤其是451Lu細(xì)胞系PRL-3表達(dá)水平最高。Transwell實(shí)驗(yàn)表明PRL-3高表達(dá)的451Lu細(xì)胞體外侵襲能力明顯高于PRL-3低表達(dá)的WM793B細(xì)胞，且451Lu細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力也明顯高于WM793B細(xì)胞。 選擇PRL-3表達(dá)最高的451Lu細(xì)胞，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染抑制PRL-3的表達(dá)，RT-PCR和Western blot驗(yàn)證了siRNA轉(zhuǎn)染成功抑制了PRL-3mRNA和蛋白的表達(dá)，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞變得更加粗短，類似上皮細(xì)胞。與空白對(duì)照組和脂質(zhì)體組相比，其生長(zhǎng)曲線右偏，細(xì)胞增殖速度減慢，凋亡率升高(P 0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染組在相同時(shí)間內(nèi)發(fā)生定向遷移的細(xì)胞數(shù)比空白對(duì)照組和脂質(zhì)體組要少得多。Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組和脂質(zhì)體組（P均0.05）。我們依據(jù)PRL-3的siRNA序列構(gòu)建了干涉PRL-3的慢病毒shRNA載體，裸鼠皮下分別接種未經(jīng)任何處理的黑素瘤細(xì)胞作為對(duì)照、病毒空載體感染的黑素瘤細(xì)胞和慢病毒shRNA感染的黑素瘤細(xì)胞，在第18天（P 0.05）、第21天和第24天（P均0.01），慢病毒shRNA感染組細(xì)胞皮下接種形成的腫瘤明顯小于對(duì)照組和空載體組。裸鼠尾靜脈分別注射黑素瘤451Lu細(xì)胞(對(duì)照組)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu細(xì)胞，3周后發(fā)現(xiàn)慢病毒shRNA干擾PRL-3后小鼠形成轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。 本課題分析了MM組織和MM細(xì)胞系PRL-3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PRL-3的表達(dá)水平與MM轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步選擇PRL-3高表達(dá)的惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞，干擾PRL-3的表達(dá)后其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，增殖能力減弱、凋亡增加，且體外遷移能力、侵襲能力減弱，體內(nèi)成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力也明顯減弱，表明PRL-3在MM的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，抑制PRL-3的表達(dá)和功能可以抑制MM的增殖和轉(zhuǎn)移，對(duì)PRL-3的抑制有望成為治療MM的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2406791