發(fā)布時間：2018-11-25 08:42

【摘要】：自噬是真核細胞的一種具有自我保護功能的生理現(xiàn)象,主要幫助細胞適應(yīng)各種不良刺激,是細胞維持內(nèi)環(huán)境的自穩(wěn)并且實現(xiàn)自我更新的基本途徑。紫外線輻射可以使皮膚角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生活性氧片段(Reactive oxygen species, ROS),進一步使組織和細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化以及DNA的損害。本課題研究了中波紫外線(Ultraviolet-B, UVB)對人皮膚角質(zhì)形成細胞(Keratinocyte, KC)產(chǎn)生的自噬和氧化應(yīng)激現(xiàn)象,并引入抗氧化劑,初步探討自噬和氧化應(yīng)激相關(guān)的可能的信號通路,為將來深入發(fā)掘白噬和氧化應(yīng)激之間相互調(diào)控的分子機制,以及在疾病發(fā)生中的作用奠定實驗基礎(chǔ)。 本研究第一部分首先對比了不同劑量的UVB和不同濃度的過氧化氫(H2O2)刺激對角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞和人原代KC增殖活力的影響,確定合適的UVB劑量和H2O2作用濃度；第二部分對比了相同UVB輻照后以上兩種細胞自噬囊泡表達水平上的差異；第三部分檢測了UVB照射后原代KC氧化應(yīng)激水平的變化,以外源性H2O2孵育為陽性對照,并引入抗氧化劑α-硫辛酸(alfa-lipoic acid, LA),了解其是否能夠改變UVB輻照相關(guān)的氧化壓力；第四部分檢測了UVB照射以及UVB照射+LA處理后原代KC自噬表達水平的變化。 本課題研究目的： 1.了解兩種角質(zhì)形成細胞對紫外線輻射和外源性H2O2刺激耐受程度。 2.對比UVB輻射后兩種角質(zhì)形成細胞自噬囊泡表達水平的差異。 3.抗氧化劑干預(yù)是否改變UVB造成的原代KC氧化應(yīng)激水平和自噬水平,分析自噬與氧化壓力水平的相關(guān)性及可能的分子機制。 研究方法： 1.建立UVB輻射和外源性H2O2相關(guān)的氧化應(yīng)激模型,倒置顯微鏡下觀察UVB和H2O2刺激后細胞形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)的變化,并用MTT法檢測UVB、H2O2對細胞增殖活力的影響。 2.采用MDC染色法對自噬體和晚期自噬囊泡進行染色,運用倒置熒光顯微鏡在UVB輻照和(或)抗氧化劑孵育后相應(yīng)的時間點對染色后的細胞進行攝片,統(tǒng)計每個視野自噬囊泡表達陽性的百分比。 3.運用化學(xué)法檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和總抗氧化能力TAOC。 4.2'7'-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針對細胞內(nèi)ROS進行染色,倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強度的變化,并用流式細胞術(shù)對綠色熒光進行定量。采用免疫印跡法檢測自噬自噬相關(guān)蛋白磷酸化mTOR、LC3、p62,對自噬表達水平進行半定量分析。 研究結(jié)果： 1.UVB和H202對原代KC、HaCaT細胞形態(tài)和增殖活力的損傷成劑量相關(guān)性,原代角質(zhì)形成細胞更耐受UVB和H2O2的損傷。 2.MDC染色法表明相同劑量的UVB照射對原代KC和HaCaT細胞自噬水平產(chǎn)生不同的結(jié)果,5、10、20mJ/cm2UVB照射能促進HaCaT細胞自噬囊泡的表達水平增加,且有劑量依賴性,而對原代角質(zhì)形成細胞自噬囊泡表達水平未產(chǎn)生顯著影響；40mJ/cm2UVB照射后HaCaT細胞自噬囊泡表達水平高于未照射組但較20mJ/cm2組低,而40mJ/cm2UVB照射顯著抑制原代KC自噬水平的表達。 3.10mM的H2O2和40mJ/cm2的UVB均能顯著誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞ROS和MDA的生成,且照射后4h細胞內(nèi)ROS、MDA水平較照射后12h為高,照射后12hROS、MDA水平基本恢復(fù)正常；加抗氧化劑LA孵育后能減輕照射后4h的ROS、MDA水平。 4.MDC染色顯示UVB照射+LA孵育4h或12h原代KC自噬囊泡表達陽性的細胞比例較單純UVB照射組增加,以UVB照射+LA孵育12h者增加更為顯著；單純UVB照射后12h細胞自噬囊泡表達陽性的細胞比例及LC3水平較照射后4h上調(diào)。 5.LA和H202均有誘導(dǎo)原代KC自噬囊泡形成及LC3水平上調(diào)的作用,免疫印跡法檢測磷酸化mTOR和p62均未顯示明顯差異。 結(jié)論： 1. HaCaT細胞和原代KC對相同UVB輻射體現(xiàn)了不一致的增殖抑制效應(yīng)和自噬表達結(jié)果,原代KC更耐受UVB的輻射損傷,UVB照射抑制了原代角質(zhì)形成細胞自噬囊泡的形成。 2.UVB輻射和外源性H202孵育均能夠使原代KC氧化應(yīng)激壓力增加,照射后隨著時間推移細胞有自行修復(fù)的能力,表現(xiàn)為ROS和MDA水平恢復(fù)正常,及UVB對自噬的抑制效應(yīng)減輕。 3.LA能夠減輕UVB照射相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷,并且能夠減輕UVB照射導(dǎo)致的自噬抑制現(xiàn)象,LA的保護作用可能通過誘導(dǎo)自噬上調(diào)來實現(xiàn)。 4.抗氧化劑LA和促氧化劑H202上調(diào)LC3的表達均通過非mTOR途徑實現(xiàn),p62可能沒有參與兩者相關(guān)的自噬調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R751

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 閔瑋,駱丹,林向飛,繆旭,吉璽,朱潔;中波紫外線輻射對原代及永生化角質(zhì)形成細胞損傷能力的比較研究[J];中國麻風皮膚病雜志;2004年06期

2 張青松;顧恒;;UVB對人皮膚成纖維細胞自噬影響的初步研究[J];中國麻風皮膚病雜志;2008年07期

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本文編號：2355486